實訓14　大腸桿菌的平板菌落計數(shù)

一、實訓目的

（1）學習平板菌落計數(shù)的基本原理和方法。

（2）熟練掌握倒平板技術和系列稀釋操作技術。

二、實訓原理

平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經適當稀釋，使其中的微生物充分分散為單個細胞，取一定量的稀釋液接種到平板上，經過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成的肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，長成的一個單菌落也可能來自樣品中的2～3個或更多個細胞，因此平板菌落計數(shù)的結果往往偏低?，F(xiàn)在常使用菌落形成單位（colony－forming unit，CFU）。

該計數(shù)法的缺點是操作較煩瑣，需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響。但是這種計數(shù)方法最大的優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗，以及食品、飲料和水等含菌指數(shù)或污染度的檢測。

三、實訓器材

1．材料

大腸桿菌懸液、LB培養(yǎng)基。

2．器具

1mL、5mL無菌吸管，無菌培養(yǎng)皿，無菌水，無菌試管，試管架和記號筆等。

四、實訓步驟

1．編號

取無菌培養(yǎng)皿9套，分別標明為10^－4、10－5、10－6各3套。另取6支盛有4．5mL無菌水的試管，排列于試管架上，分別標記為10－1、10－2、10^－3、10^－4、10^－5、10^－6。

2．稀釋

用1mL無菌吸管吸取1mL已充分混勻的大腸桿菌懸液，精確地放0．5mL至10－1試管中，此即為10倍稀釋。注意放液時吸管尖端不要碰到液面，將試管充分振蕩、混勻。另取一支1mL吸管插入10^－1試管中來回吹吸菌液三次，進一步將菌體分散、混勻。動作不要太猛太快，吸時插入，吹時提出，再用此吸管吸取10－1菌液1mL，精確地放0．5mL至10^－2試管中，此即為100倍稀釋，依次類推。

3．取樣

用三支1mL無菌吸管分別吸取10^－4、10^－5、10^－6的稀釋菌液各0．2mL，對應放入編好號的無菌培養(yǎng)皿中。

4．倒平板

盡快向上述盛有不同稀釋濃度的菌液的培養(yǎng)皿中倒入熔化后冷卻至45℃的LB培養(yǎng)基15～20mL，置水平位置迅速旋動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻。

5．培養(yǎng)

將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48h。

6．計數(shù)

算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進行計算：

每毫升中菌落形成單位（CFU／mL）＝同一稀釋度三次重復的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

五、結果記錄

將培養(yǎng)后菌落計數(shù)結果填入表3－8。

表3－8　菌落計數(shù)結果統(tǒng)計表

六、思考題

（1）為什么熔化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板？

（2）要使平板菌落計數(shù)準確，需要掌握哪幾個關鍵操作？為什么？

（3）同一種菌液用血球計數(shù)板和平板菌落計數(shù)法同時計數(shù)，所得結果是否一樣？為什么？

（4）試比較平板菌落計數(shù)法和顯微鏡下直接計數(shù)法的優(yōu)缺點。