實驗十二　大腸桿菌抗藥性突變株的篩選

一、實驗目的

學習用梯度平板法分離抗藥性突變株的原理和方法。

二、實驗原理

基因中堿基順序的改變可導致微生物細胞的遺傳變異，這種變異有時能使細胞在有害的環(huán)境中存活下來，抗藥性突變就是一個例子。微生物的抗藥性突變是DNA分子的某一特定位置的結(jié)構(gòu)改變所致，與藥物的存在無關(guān)，某種藥物的存在只是分離某種抗藥性菌株的一種手段，而不是作為引發(fā)突變的誘導物。在含有一定抑制生長藥物濃度的平板上涂布大量的細胞群體，極個別抗性突變的細胞會在平板上長成菌落。將這些菌落提取純化，進一步進行抗性試驗，就可以得到所需要的抗藥性菌株?？顾幮猿Ｓ米鬟z傳標記，因而掌握抗藥性突變株的分離篩選方法是十分必要的。

在自然條件下，想要獲得有抗性的細菌是很困難的。當給予適當?shù)奈锢砘瘜W條件時，其突變率會大大增加，如α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外線、微波等。DNA對紫外線（UV）有強烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，它比嘌呤更為敏感，而且紫外線誘變要求實驗條件低、試驗操作簡單，因此，常被用作誘變劑，用于微生物菌種選育。

經(jīng)誘變處理后的微生物群體中，雖然突變數(shù)目大大增加，但所占的比例仍然是整個群體中的極少數(shù)。為了快速、準確地得到所需的突變體，必須設(shè)計一個合理的篩選方法，以殺死大量的未發(fā)生突變的野生型，而保留極少數(shù)的突變型。梯度平板法是篩選抗藥性突變型的一種簡便有效的方法，其操作要點是：先加入不含藥物的培養(yǎng)基，立即把培養(yǎng)皿斜放，待培養(yǎng)基凝固后形成一個斜面，再將培養(yǎng)皿平放，倒入含一定濃度藥物的培養(yǎng)基，使其凝固，這樣就形成了一個藥物濃度梯度由濃到稀的梯度培養(yǎng)基。將誘變處理后的菌液涂布于培養(yǎng)基表面，經(jīng)培養(yǎng)后，在藥物濃度比較高的位置出現(xiàn)的菌落就是抗藥性突變株。

三、實驗器材

（一）菌種

大腸桿菌（Escherichila coli）。

（二）培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，2×（2倍濃度，營養(yǎng)成分濃度為普通培養(yǎng)基的2倍）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液（分裝于離心管中，每管裝5mL），含100μg／mL鏈霉素的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

（三）器皿

培養(yǎng)皿（直徑6cm、9cm）、玻璃涂棒、移液管、滴管、臺式低速離心機、磁力攪拌器等。

（四）試劑及溶液

生理鹽水、鏈霉素溶液。

四、實驗步驟

（一）制備菌液

從已活化的斜面菌種上挑1環(huán)大腸桿菌于裝有5mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的無菌離心管中（接2支離心管），置37℃條件下培養(yǎng)16h左右，離心（3 500rpm，10min），棄上清液后再用生理鹽水洗滌2次，棄上清液，重新懸浮于5mL的生理鹽水中。將2支離心管的菌液一并倒入裝有玻璃珠的三角瓶中，充分振動以分散細胞，制成濃度為108／mL的菌液。然后吸3mL菌液于裝有磁力攪拌棒的培養(yǎng)皿（直徑6cm）中。

（二）紫外線照射

（1）預熱紫外燈：紫外燈功率為15W，照射距離30cm（可在超凈工作臺中進行）。照射前先開燈預熱30min。

（2）照射：將培養(yǎng)皿放在磁力攪拌器上，先照射1min后再打開皿蓋并開始計時，照射2min后，立即蓋上皿蓋，關(guān)閉紫外燈。

（三）增殖培養(yǎng)（在暗室紅燈或黃燈下操作）

照射完畢，用無菌滴管將全部菌液吸到含有3mL 2×牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的離心管中，混勻后用黑紙包裹嚴密，置37℃培養(yǎng)過夜。

（四）梯度培養(yǎng)皿的制備

取10mL牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基于直徑9cm的培養(yǎng)皿中，立即將培養(yǎng)皿斜放，使高處的培養(yǎng)基正好位于皿邊與皿底的交接處。待凝固后，將培養(yǎng)皿平放，再加入含有鏈霉素（100μg／mL）的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基10mL。凝固后，便得到鏈霉素從0到100μg／mL逐漸升高的濃度梯度培養(yǎng)皿。然后在皿底藥物濃度從低到高的方向做一個“→”符號標記。

圖12－1　梯度平板示意圖

1．底層培養(yǎng)基　2．上層培養(yǎng)基　3．含100μg／mL鏈霉素　4．培養(yǎng)皿傾斜角

（五）涂布菌液

將增殖后的菌液進行離心（3 500rpm，10min），棄上清液，再加入少量生理鹽水（約0．2mL），振蕩混勻后將全部菌液均勻涂布于整個梯度培養(yǎng)皿表面，并將它倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。將出現(xiàn)于高藥物濃度區(qū)域內(nèi)的單菌落分別接種到斜面上，經(jīng)培養(yǎng)后做抗藥性測定。

（六）抗藥性測定

（1）制備含藥平板：取鏈霉素溶液（750μg／mL）0．2，0．4，0．6，0．8mL，分別加到無菌培養(yǎng)皿中，再加入融化并冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基15mL，立即混勻，平置凝固后即成為含有10，20，30，40μg／mL鏈霉素濃度的藥物平板，另取一個平板（不含藥物）作對照。

（2）抗藥性的測定：將上述每個平皿的底部用記號筆劃成8等份，并注明1～8號，然后將待測抗藥菌株逐個劃線接種于上述4種濃度的藥物平板和對照平板上，同時每皿留一格接種出發(fā)菌株。接種后將培養(yǎng)皿倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天觀察各菌株的生長情況，并記錄結(jié)果。

五、實驗記錄

將各菌株抗藥性測定結(jié)果記錄于下表中：

注：以“＋”表示生長，“－”表示不生長。

結(jié)果：你選到抗藥菌株__________株，最高抗藥性達__________μg／mL。

六、思考題

（1）未經(jīng)誘變的菌株在含藥平板上是否有菌落出現(xiàn)？為什么？

（2）你選出的抗藥性菌株中，如有一抗鏈霉素的菌株在含藥平板上能生長，在不含藥平板上反而不生長，這說明什么？

參考文獻

［1］沈萍，范秀容，李廣武．微生物學實驗［M］．3版．北京：高等教育出版社，1999．

［2］周德慶．微生物學實驗教程［M］．2版．北京：高等教育出版社，2006．