三、實驗步驟

（1）制備磷酸緩沖液：KH₂PO₄3．4g；K₂HPO₄8．7g；Na₂HPO₄13．36g；蒸餾水200ml。

（2）無機鹽溶液：MgSO₄·7H2O 100ml，22．5g/L；CaCl₂100ml，27．5g/L；FeCl₃·6H2O，0．25g/L。

（3）氯化銨儲備液：NH₄Cl3．82g溶于100ml蒸餾水中，使用時，可按需要對儲備液進行1:1 000、1:50稀釋，獲得1:1 000、1:50的氮源使用液。

（4）Tris緩沖液：1．21g三羥甲基胺基甲烷溶于50ml蒸餾水中。

（5）葡萄糖儲備液：10g葡萄糖溶于100ml蒸餾水，使用時，可稀釋獲得葡萄糖使用液為10 000mg/L（取10ml葡萄糖儲備液稀釋到100ml中）。

（6）分別制備溶液1、溶液2。

溶液1：加入磷酸緩沖液150mL，22．5g/L的MgSO₄·7H2O 1ml，27．5g/L CaCl₂1ml，0．25g/LFeCl₃·6H2O1ml，蒸餾水600ml。

溶液2：NH4Cl溶液15ml，蒸餾水735ml。

（7）含不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液的制備：取100ml溶液1和100ml溶液2，制成混合液；將混合液取25ml分裝到8個50ml的錐形瓶中；再分別取葡萄糖使用液0、0．625、1．25ml和儲備液0．25ml、0．5ml、0．75ml、1ml、1．25ml于錐形瓶中，獲得GM1－8，葡萄糖濃度分別為0mg/L、250mg/L、500mg/L、1 000mg/L、2 000mg/L、3 000mg/L、4 000mg/L、5 000mg/L；每個試管移裝5ml，對應貼標簽GM1，GM2，…，GM8，備用。

（8）含不同濃度氮培養(yǎng)液的制備：于10個50ml錐形瓶中，按照表5－1所示，各溶液分別取不同體積，使配成含不同濃度氮的培養(yǎng)液。然后分別移5ml培養(yǎng)液于試管中，對應貼標簽N1，N2，…，N10，備用。

表5-1　含不同濃度氮培養(yǎng)液的制備配方

（9）不同pH營養(yǎng)液的制備：取150ml溶液1和150ml溶液2于500ml錐形瓶A中混合，取一半倒入另一潔凈250ml錐形瓶B中，用NaOH調(diào)節(jié)pH為8，然后取25ml于50ml錐形瓶C中，加入1．25ml葡萄糖儲備液，獲得pH為8的營養(yǎng)液；再用NaOH調(diào)節(jié)B瓶中溶液使pH為9后，取25ml與另一50ml錐形瓶D中，加入1．25ml葡萄糖儲備液，獲得pH為9的營養(yǎng)液；依次操作，直到pH為11。A瓶中剩余混合液，用H₂SO₄調(diào)節(jié)pH為7，然后取25ml于另一50ml錐形瓶G中，加入1．25ml葡萄糖儲備液，獲得pH為7的營養(yǎng)液；再用H₂SO₄調(diào)節(jié)A瓶中溶液使pH為6，重復上述操作，依次獲得從pH＝2到pH＝11的培養(yǎng)液。將這些不同pH的培養(yǎng)液，移取5ml分裝于試管中，對應貼上標簽pH2，pH3，…，pH11，備用。

（10）含不同濃度磷培養(yǎng)液的制備：首先制備溶液A，稱1．21g Tris溶于50ml蒸餾水中，加入44．2ml0．2M的HCl，調(diào)節(jié)pH為7．2，使溶液體積為100ml；另取氯化銨溶液4ml、22．5g/L的MgSO₄·7H2O 0．267ml、27．5g/L的CaCl₂0．267ml、0．25g/L的FeCl₃·6H2O 0．267ml，溶于蒸餾水中，稀釋到100ml，獲得溶液B；最后混合溶液A、B，得到200ml混合Tris溶液；取10ml磷酸鹽緩沖液，稀釋到25ml，得到磷使用液。于9個50ml錐形瓶中，按下列方法配制含不同濃度磷的培養(yǎng)液，見表5－2。將不同濃度磷的培養(yǎng)液分裝試管，每個試管移裝5ml，對應貼標簽P1，P2，…，P9，備用。

表5-2　含不同濃度磷培養(yǎng)液的制備配方

（11）不同電子供體、電子受體培養(yǎng)液的制備：分別取75ml溶液1和75ml溶液2混合，加入3ml葡萄糖儲備液，得到混合液；取20ml混合液于50ml錐形瓶中，得到G1；取5ml混合液于試管中，得到G2，分別貼標簽G1、G2。

另再分別取75ml溶液1和75ml溶液2混合，加入3ml葡萄糖儲備液、0．375g硝酸鈉，得到混合液；取5ml混合液分裝于試管中，得到G3，貼標簽G3。

另再分別取75ml溶液1和75ml溶液2混合，加入0．69g醋酸鈉，得到混合液；取20ml混合液于錐形瓶中，得到A1；其余取5ml分裝于試管中，得到A2，分別貼標簽A1、A2。

另再分別取75ml溶液1和75ml溶液2混合，加入0．69g醋酸鈉、0．375g硝酸鈉，得到混合液；取5ml混合液分裝于試管中，得到A3，貼標簽A3。

上述各步，可根據(jù)教學課時靈活掌握。時間不充足，可由實驗員準備到這一步。上述制備數(shù)量為5組，可根據(jù)學生人數(shù)，進行等比例放大縮小。

（12）接種與培養(yǎng)：分別對具5ml培養(yǎng)液的試管、20ml培養(yǎng)液的錐形瓶接種0．5ml、2ml沉降好的污泥；往貼好標簽G2、G3、A2、A3的試管、培養(yǎng)瓶倒入溶解好的蠟于液體表面，防止液體與空氣接觸，使成厭氧條件。G1、A1不倒蠟于液體表面。

用帶砂芯的橡膠塞將試管口和錐形瓶瓶口部塞住，在35℃下培養(yǎng)48小時。

（13）測量：48小時后，回到實驗室，搖晃使每個試管充分混勻；在420nm波長下，用分光光度計測定其吸光度，并記錄數(shù)據(jù)。

思考題

1．實驗前，請思考不同濃度葡萄糖營養(yǎng)液培養(yǎng)組中微生物生長的規(guī)律并說明理由。實驗結(jié)果是否與你預期的一致？為什么？

2．實驗前，請思考不同濃度氮營養(yǎng)液培養(yǎng)組中微生物生長的規(guī)律并說明理由。實驗結(jié)果是否與你預期的一致？為什么？

3．實驗前，請思考不同濃度磷營養(yǎng)液培養(yǎng)組中微生物生長的規(guī)律并說明理由。實驗結(jié)果是否與你預期的一致？為什么？

4．實驗前，請思考在不同電子供體、電子受體的實驗中微生物生長的規(guī)律并說明理由。試驗結(jié)果是否與你預期的一致？為什么？

5．把A1、A2、A3培養(yǎng)液的醋酸鹽換成乙醇，微生物的生長情況如何？

6．詳細描述實驗現(xiàn)象，分析實驗過程出現(xiàn)的錯誤，并分析原因。