五、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism analysis，RFLP)分析

1.概述

限制性片段長度多態(tài)性分析經(jīng)常被用于細菌分離菌上。這個方法首先要從細菌分離菌的純培養(yǎng)物中提取總DNA，這個過程使用標準方法進行溶胞和制備DNA基因組。基因組DNA用核酸內切酶(通常認識4～6bp長的特異DNA序列)切割成小片段。一些內切酶的靶位點見表15-9，DNA片段通常用凝膠電泳分離，隨后用溴化乙錠染色和紫外線照射顯色。如果限制酶在基因組DNA內許多位點切割，就能產(chǎn)生幾個甚至幾百個DNA片段。電泳后這些片段的圖形和探針探索會產(chǎn)生具有原始細菌分離物特征的指紋。

圖15-12　lacZ基因的互補(引自Maloy，Cronan and Freifelder，1994)

表15-9　　一些限制性內切核酸酶的靶位點

續(xù)表

A^*

是N⁶-甲基腺嘌呤，C

*

是5-甲基胞嘧啶。

注:識別序列從5'端到3'端，只給出一條鏈，箭頭指示切割點。圓括號里的堿基表示二者之一都可能占據(jù)這個位置。堿基已知被特異甲基化酶修飾的用星號^*表示。

引自Old and Primrose，1989。

2.全基因組的RFLP分析(RFLP analysis of whole genomes)

溶胞以后，細菌DNA可像前述那樣被分離和純化，然后可用限制酶在特異識別位點進行切割。因為插入、缺失或置換一個堿基引起的變化能產(chǎn)生或消除一個識別位點，所以限制位點也會變化，即使在親緣關系很近的細菌中也是如此。親緣關系遠的細菌就會具有許多位置不同的限制位點，這些微妙的變化稱為多態(tài)性。DNA多態(tài)性產(chǎn)生不同識別位點，因而導致不同的分離菌產(chǎn)生不同大小的限制片段。凝膠電泳后用溴化乙錠染色所觀察到的圖形可拍照用作實際指紋。

然而，往往難以解釋大量的限制片段，并且在某些情況下限制片段很多，所以觀察到的只是不清晰的成片電泳帶。為了簡化這種圖形，可把這些DNA片段轉移到一種膜上，只有含特異序列的片段能用基因探針檢出。許多革蘭氏陰性腸細菌含有重復的DNA序列，它們位于這種細菌染色體的不同位點。因為這些序列在進化上是保守的，所以利用這些序列的基因探針可以被設計出來。如果一特定分離菌的基因組DNA用特異的限制酶切割，那么某些DNA片段會含有這種保守性重復DNA序列。使用基因探針可鑒別這些片段，并且，同種的兩個不同株會產(chǎn)生不同的指紋圖形。

3.PCR序列的RFLP分析(RFLP analysis of PCR sequences)

RFLP分析還能用于鑒別或確證特異的細菌相關的特異基因序列而不是全細菌DNA。這項分析技術先對特異序列(如16S rDNA序列)進行PCR擴增，然后進行限制酶酶切。所有的細菌都含編碼核糖體RNA的16S rDNA序列，而且這些16S rDNA序列的部分是高度保守的，而其他一些部分序列對每一機體來說是特異的。從這種保守序列設計出的引物稱為“通用”引物，它在理論上會擴增所有已知細菌的16S rDNA。兩個外部通用引物之間被擴增的DNA含有能被限制酶切割的獨特序列，切割后會產(chǎn)生細菌分離的指紋。PCR-RFLP分析能描述細菌屬自然種群的特征。一般擴增DNA至少要用兩酶切割才能確保對不同分離菌的判定。

4.脈沖電場凝膠電泳

脈沖電傷凝膠電泳(pulse field gel eletrophoresis，PFGE)是分離高分子質量DNA的一種電泳技術，與一般的電泳不同。這是使DNA分子處在兩個相互垂直的，交替變換的電場中移動，使分子質量大小不等的DNA片段分開。用這種電泳技術目前可分辨5000～20000kb的DNA分子。PFGE可用于多態(tài)性檢測。與正常的RFLP相比較，它不需DNA向膜的轉移，也不需用基因探針檢出特異片段。限制酶酶切物在電泳中被分離染色，產(chǎn)生指紋。PFGE用于檢出相對分子質量比正常RFLP中高的片段，這些片段通常大于40kb。這些大片段往往通過使用少數(shù)的切割酶產(chǎn)生(例如Not I)。全部的溶胞和限制酶酶切過程都在由細菌肉湯培養(yǎng)物和熔化的瓊脂糖構成的填料進行。電泳前，這種填料熔進凝膠上樣孔。這種方法可減少DNA的親剪切。

5.RFLP分析的優(yōu)點和不足之處

RFLP分析常用于鑒別特異細菌分離物。RFLP結合基因探針分析的最大優(yōu)點是產(chǎn)生的帶型清楚明確。這是因為相當大量的DNA被切割，電泳和染色后的DNA片段易于顯示出來。相反，PCR產(chǎn)生的指紋(如AP-PCR或ERIC PCR產(chǎn)生的指紋)難以再現(xiàn)并可能含“模糊的”或“假的”帶，使其難以解釋。

RFLP分析用的限制酶選擇通常憑經(jīng)驗，正常情況下必須使用多種酶。例如，如果將單酶用于兩種染色體制品，隨后的基因探針分析產(chǎn)生兩種不同的指紋，那么毫無疑問這些分離菌是不同的。但是，如果產(chǎn)生的指紋是一樣的，這倒不一定意味著這些分離菌是一樣的，因為一種酶可能在兩種DNA制品的同一位點進行切割。