一、目的要求

了解植物病原細(xì)菌分離的基本原理，掌握平板劃線分離法及純化技術(shù)，熟悉劃線分離的本質(zhì)是稀釋分離，以獲得單菌落。

二、材料和用具

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.甘藍(lán)黑腐病新鮮病葉若干。

2.培養(yǎng)基：牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）。

3.滅菌水（三角瓶裝）。

4.藥品：70%的酒精、95%的酒精、0.1%的升汞液或5%的次氯酸鈉。

（二）實(shí)驗(yàn)用具

滅菌培養(yǎng)皿、試管、吸管、吸水紙、移植針、移植鉺、小刀、紗布、酒精燈、玻璃棒、鉛筆、紙、標(biāo)簽紙、棉花、電爐、鑷子、鋁鍋等。

三、內(nèi)容和方法

（一）實(shí)驗(yàn)原理

在病組織的各個(gè)部位和其他基物中，病原細(xì)菌常常是和其他微生物混雜在一起的。 為了獲得某微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、酸堿度、氧氣等條件的特殊要求，供給它們適宜的生活條件，即讓病原細(xì)菌生活在適宜的培養(yǎng)基上，或加入某種抑制劑創(chuàng)造只利于此菌生長(zhǎng)，而抑制其他菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而得到該菌的純菌株。 為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進(jìn)行分離菌的純化，純化的方法類似于分離工作中采用的稀釋分離法和劃線分離法。

（二）平板劃線分離法

1.制平板

預(yù)先把熔化好的NA培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉(zhuǎn)放在30℃恒溫箱中，使表面無(wú)水滴凝結(jié)，48h后取出備用。 也可凝成平板后直接使用。

2.取材

將細(xì)菌葉斑病（如甘藍(lán)黑腐?。┬迈r病葉用自來(lái)水沖洗掉表面的臟物（如泥土），選擇典型的單個(gè)病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣（病健交界處）切取小塊（每邊長(zhǎng)3~4mm）病組織數(shù)塊。

3.淋濕組織表面或表皮毛

將病組織放入70%的酒精中浸泡2~3s，消除寄主表面的氣泡，淋濕組織表面或表皮毛。

4.表面消毒

把病組織移入0.1%的升汞液中處理0.5~5min。

5.制菌懸液

用在酒精燈火焰上滅菌的鑷子，將已經(jīng)用消毒水沖洗的分離材料夾1塊放在裝有少量滅菌水（1m L）的滅菌培養(yǎng)皿中，使用已經(jīng)火焰滅菌的玻璃棒，將分離材料搗碎，并靜置5~10min，制成菌懸浮液。

6.涂抹

用滅菌的移植餌（或移植環(huán)）蘸1環(huán)菌懸液，在平板培養(yǎng)基表面一側(cè)邊緣反復(fù)涂抹。

7.第一次平板劃線

把移植餌重新滅菌，從上述涂抹區(qū)劃出2條直線。

8.第二次平板劃線

將平板轉(zhuǎn)動(dòng)一定角度，用滅菌后的移植餌從第一次劃線的末端進(jìn)行第二次劃線。

9.第三次平板劃線

再轉(zhuǎn)動(dòng)平板，繼續(xù)劃線，至基本劃滿整個(gè)平板（圖11-1）。

圖11-1 植物病原細(xì)菌平板劃線分離法示意圖

10.培養(yǎng)

劃線完畢后，倒置平板，寫上標(biāo)簽，并于26~28℃恒溫箱中培養(yǎng)1~3d。

11.純化

在劃線分離平板培養(yǎng)皿中選擇要求得到的典型菌落，從單個(gè)菌落上蘸少許菌液，然后在新的平板培養(yǎng)基上涂抹、劃線。 如果第二次培養(yǎng)長(zhǎng)出的劃線菌落一致，就可選1個(gè)單菌落移到試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)而獲得純菌種。 反之長(zhǎng)出的菌落不一致，還應(yīng)繼續(xù)劃線純化，直至菌落一致。

（三）注意事項(xiàng)

1.整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)保持無(wú)菌，防止污染。

2.平板劃線時(shí)要注意移植餌（或移植環(huán)）的溫度不能過(guò)高，且前兩次劃線后要對(duì)移植餌（或移植環(huán)）進(jìn)行滅菌。

四、實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)

3學(xué)時(shí)。

五、作業(yè)與思考題

1.每人交合格培養(yǎng)皿2個(gè)，并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告1份。

2.如果要從土壤中分離某種病原菌，應(yīng)當(dāng)采取什么樣的分離方法更有效？

3.為什么分離材料要取病健交界處，且不能切取過(guò)大或過(guò)?。?/p>

4.在分離、純化步驟中，要避免污染應(yīng)注意哪些地方？

5.怎樣判斷你獲得的病原菌的菌種是否是純培養(yǎng)物？