在酸性環(huán)境下,蛋白質(zhì)分子可解離出帶正電荷的NH 3+,它可與染料的陰離子產(chǎn)生顏色反應(yīng)。常用的染料有氨基黑、麗春紅、考馬斯亮藍(lán)、鄰苯三酚紅鉬等。前兩種常作為血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳或瓊脂糖凝膠電泳的染料?？捡R斯亮藍(lán)常用于需更高呈色靈敏度的蛋白電泳,也用于測(cè)定尿液、腦脊液等蛋白質(zhì),優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、靈敏,缺點(diǎn)是不同蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合力不一致,且試劑對(duì)比色杯有吸附作用。

(一)血漿(清)清蛋白測(cè)定

清蛋白結(jié)合的染料有多種,其中溴甲酚綠(bromcresol green,BCG)和溴甲酚紫(bromcresol purple,BCP)最常用。BCP法受球蛋白和其他血漿蛋白的干擾較小,但與BCG法相比,靈敏度較低。此外BCP與非人源性清蛋白結(jié)合力相當(dāng)弱,不適合用于動(dòng)物標(biāo)本中清蛋白含量測(cè)定,而質(zhì)控血清多用動(dòng)物血清制備,故BCP的應(yīng)用受到一定限制。

【原理】 清蛋白在p H4.2的緩沖液中帶正電荷,在有非離子型表面活性劑存在時(shí),可與帶負(fù)電荷的染料溴甲酚綠結(jié)合形成藍(lán)綠色復(fù)合物,在波長(zhǎng)628nm處有吸收峰,其顏色深淺與清蛋白濃度成正比,與同樣處理的清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較,可求得血清清蛋白含量。

【試劑與器材】 可購(gòu)商品試劑或自配。

1.BCG試劑 向約950ml蒸餾水中加入0.105g BCG(或0.108g BCG鈉鹽),8.85g琥珀酸,0.1g疊氮鈉,4ml濃度為300g/L聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)。完全溶解后,用6mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至p H4.15~4.25。用蒸餾水加至1L。試劑配成后,分光光度計(jì)628nm,蒸餾水調(diào)零測(cè)BCG試劑的吸光度,應(yīng)在0.150A左右。貯存于聚乙烯塑料瓶?jī)?nèi),密塞室溫保存,至少可穩(wěn)定6個(gè)月。

2.BCG空白試劑 除不加入BCG外,其余成分和配制程序與BCG試劑配制相同。

3.60g/L清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 稱取人血清清蛋白6g、疊氮鈉50mg,溶于蒸餾水中并緩慢攪拌助溶,配成100ml。密封貯存于4℃冰箱,可穩(wěn)定半年。也可用定值參考血清作清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。

4.儀器 自動(dòng)生化分析儀或分光光度計(jì)。

【操作】

1.自動(dòng)生化分析儀分析法 參數(shù)設(shè)置參照有關(guān)儀器和試劑盒說明書。

2.手工操作法 按表6-4操作。

表6-4　BCG法測(cè)定血清清蛋白操作步驟

在628nm處用空白管調(diào)零,逐管加入BCG試劑,并立即混勻。每份血清標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)液與BCG試劑混合后,均需在30s±3s內(nèi),讀取吸光度。

如遇脂血渾濁標(biāo)本,可做標(biāo)本空白管:取血清0.02ml,加入BCG空白試劑5.0ml,波長(zhǎng)628nm,用BCG空白試劑調(diào)零,讀取標(biāo)本空白管吸光度。用測(cè)定管吸光度減去標(biāo)本空白管吸光度后的凈吸光度,計(jì)算清蛋白濃度。

【計(jì)算】

【參考區(qū)間】 成年人:40~55g/L;4-14歲兒童:38~54g/L。

【臨床意義】

1.血清清蛋白增高 常見于嚴(yán)重脫水所致的血漿濃縮,并非蛋白質(zhì)絕對(duì)量增多,或輸入過量的清蛋白。迄今尚未發(fā)現(xiàn)單純清蛋白增高的疾病。

2.血清清蛋白降低 通常與總蛋白降低原因大致相同,但有時(shí)降低程度不一致。急性降低多見于急性大出血或嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)血漿大量丟失。慢性清蛋白降低多見于肝合成清蛋白功能障礙、腎病、惡性腫瘤等,嚴(yán)重時(shí)可≤10g/L。清蛋白<20g/L時(shí),由于膠體滲透壓嚴(yán)重下降,患者常表現(xiàn)為水腫。先天性清蛋白缺乏癥并不出現(xiàn)水腫。

【質(zhì)量保證】

1.BCG是一種p H指示劑,變色閾為p H3.8(顯黃色)~5.4(顯藍(lán)綠色),因此控制反應(yīng)液的p H是本法測(cè)定的關(guān)鍵。

2.配制BCG試劑也可用其他緩沖液,如枸櫞酸鹽或乳酸鹽緩沖液。但以琥珀酸鹽緩沖液的校正曲線通過原點(diǎn),線性好,靈敏度高,成為首選推薦配方。

3.當(dāng)60g/L的清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液與BCG結(jié)合后,溶液光徑1.0ml,在628nm處測(cè)定的吸光度應(yīng)為0.811±0.035,如達(dá)不到此值,表示靈敏度較差。

4.BCG試劑除與清蛋白結(jié)合呈色外,與血清中其他多種蛋白質(zhì)也有呈色反應(yīng),但反應(yīng)在30s之內(nèi)對(duì)清蛋白特異,30s后非特異性增高。因此BCG測(cè)定時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間。

(二)血清球蛋白測(cè)定

由于球蛋白基本不結(jié)合外源性染料,目前血清球蛋白的測(cè)定實(shí)際上是一個(gè)計(jì)算值,即:球蛋白(g/L)=總蛋白(g/L)-清蛋白(g/L)。

同時(shí),計(jì)算清蛋白與球蛋白的比值(A/G),A/G=清蛋白(g/L)/球蛋白(g/L)

【參考區(qū)間】 成年人20~40g/L;A/G=(1.2~2.5)∶1。

【臨床意義】 球蛋白增高:多見于自身免疫性疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等,炎癥或急慢性感染,如結(jié)核病、麻風(fēng)病、瘧疾、黑熱病、血吸蟲病、病毒性肝炎,還見于惡性M蛋白血癥,如多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、巨球蛋白血癥等。