（一）概述

免疫酶組織化學(xué)法是免疫組織化學(xué)中最常用的方法之一，它以抗原抗體反應(yīng)為前提，借助酶組織化學(xué)，檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)特異抗原。免疫酶法與免疫熒光法相比較，酶反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)的顏色能在普通顯微鏡下觀察，也可以用電鏡觀察；制片能夠長(zhǎng)期保存。

【基本原理】　與免疫熒光法相似，不同的是將酶以共價(jià)鍵的形式結(jié)合在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，借助酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性抗原抗體復(fù)合物。

【主要特點(diǎn)】　用細(xì)胞化學(xué)方法能顯示的酶，均可用于標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫酶法染色，但實(shí)際上能用于免疫組織化學(xué)技術(shù)的酶并不多。

【標(biāo)記條件】　Sternberger等指出，用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下條件。

（1）酶催化的底物必須是特異的，而且催化反應(yīng)所形成的產(chǎn)物能在光鏡和電鏡下觀察。

（2）酶反應(yīng)的終產(chǎn)物所形成的沉淀必須穩(wěn)定，不能向周?chē)M織彌散，影響組織定位。

（3）酶應(yīng)較易提純。

（4）中性pH時(shí)，酶分子應(yīng)穩(wěn)定。

（5）在酶標(biāo)過(guò)程中，酶連接在抗體上，不能影響兩者的活性。

（6）被檢組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶。

【常用酶】　符合上述要求的，最為常用的酶是辣根過(guò)氧化物酶（horseradish　peroxidase，HRP）、堿性磷酸酶（alkaline　phosphatase，ALP）、葡萄糖氧化酶（glucose　oxidase，GOD）。

1．HRP　是一種含鐵血紅素的植物過(guò)氧化物酶，廣泛分布于植物界，因其在植物辣根中含量高而得名。它是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結(jié)合組成的一種糖蛋白，分子量為40ku，等電點(diǎn)3～9，最適pH為5．0左右。HRP易溶于水，其活性部分為鐵卟啉，稱(chēng)輔基，在過(guò)氧化氫存在時(shí)能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。酶的蛋白部分無(wú)活性。酶蛋白和鐵卟啉輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm；HRP的純度用兩者的光密度比值來(lái)衡量，以RZ（Reinheit　Zahl）來(lái)表示。一般認(rèn)為，標(biāo)記酶的RZ值為3．0左右，不應(yīng)＜2．8，RZ值越小，酶的純度越差。對(duì)于純度低、質(zhì)量差的酶，需經(jīng)純化后才能使用。

2．ALP　是一種磷酸水解酶，目前已發(fā)現(xiàn)有ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5與ALP6六種同工酶。在多種組織和細(xì)胞中有分布，如肝臟、腎臟、骨骼、腸和胎盤(pán)等，其中以肝組織中含量最高。ALP的分子量為80ku，最適pH為9．8，其活性受底物及濃度、緩沖液及其離子濃度等因素影響。ALP的活化劑有鎂離子和錳離子。抑制藥有甘氨酸、檸檬酸鹽、EDTA等。ALP對(duì)溫度具有較高的敏感性，從25℃增加到35℃，其催化反應(yīng)速度增加1．5倍。當(dāng)選用不同的底物時(shí)，ALP可催化形成不同顏色的終產(chǎn)物。目前常用的ALP大多來(lái)自于牛的腸黏膜，近年ALP標(biāo)記的抗體得到廣泛的應(yīng)用，在染色中有一主要問(wèn)題是內(nèi)源性ALP的廣泛存在。在免疫組化染色中，最常用的方法是在底物液中加入左旋咪唑，能有效去除大部分內(nèi)源性ALP。

3．GOD　是一種典型的氧化還原酶，所催化的底物為葡萄糖，分子量約160ku，由2個(gè)或4個(gè)多肽鏈構(gòu)成，酶反應(yīng)的最適pH　5～7，最適溫度是30～40℃，終產(chǎn)物穩(wěn)定，為不溶性的藍(lán)色沉淀。哺乳動(dòng)物組織內(nèi)不存在內(nèi)源性葡萄糖氧化酶，能夠很好地避免內(nèi)源性酶的干擾，因此，從理論上講，GOD應(yīng)比ALP和HRP更好。但是，GOD的分子較HRP大3倍，具有較多的氨基，在標(biāo)記時(shí)易形成廣泛的聚合，限制了其更廣泛的使用。

（二）常用免疫酶法

★直接法

【基本原理】　將酶直接標(biāo)記在特異性抗體上，然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合，形成抗原－抗體－酶復(fù)合物，再與酶的底物作用產(chǎn)生能在光鏡下直接觀察的有色的產(chǎn)物，沉積在抗原抗體反應(yīng)的部位，可對(duì)抗原進(jìn)行定性、定位以至定量研究。

【主要特點(diǎn)】　直接法簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)，非特異性背景反應(yīng)低，缺點(diǎn)是每種抗原必須分別用其酶標(biāo)記的抗體，且敏感性較間接法低。

【染色步驟】

（1）石蠟組織切片常規(guī)脫蠟、梯度乙醇入水。

（2）0．3%H2O2－甲醇液封閉，10～15min，室溫。冷凍切片、細(xì)胞涂片從此步驟開(kāi)始。

（3）水洗后PBS洗3次，每次5min。

（4）胰酶或胃蛋白酶消化進(jìn)行抗原修復(fù)，37℃，10～30min。

（5）PBS洗2次，每次5min。

（6）正常血清孵育，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫，15min。

（7）甩掉切片上的血清不漂洗，加酶標(biāo)記抗體，37℃，30min，置濕盒內(nèi)。

（8）PBS洗3次，每次5min。

（9）加酶底物顯色。顯微鏡下觀察控制呈色反應(yīng)，以結(jié)果清晰，背景無(wú)非特異性染色為度。

（10）自來(lái)水充分沖洗。

（11）蘇木素復(fù)染胞核，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)。

（12）梯度乙醇脫水、透明、封片。

★間接法

【基本原理】　先將未標(biāo)記的特異性抗體（一抗）與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用二抗（酶標(biāo)抗體）與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，形成抗原－抗體－酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后與酶的底物作用產(chǎn)生能在光鏡下直接觀察的有色產(chǎn)物。

【主要特點(diǎn)】　選擇一抗和二抗，必須保證兩者能發(fā)生連接，如一抗是由大鼠產(chǎn)生的，則二抗必須是酶標(biāo)記的抗大鼠的免疫球蛋白，例如兔抗大鼠、羊抗大鼠。如果選擇的二抗為羊抗兔，將不能正常反應(yīng)。間接法的優(yōu)點(diǎn)是用一種酶標(biāo)抗體，可以應(yīng)用于多種一抗，而且敏感性也優(yōu)于直接法。

【染色步驟】

（1）～（6）同“直接法”。

（7）甩掉正常血清，滴加適當(dāng)稀釋度的一抗，37℃，30～60min或4℃過(guò)夜，置濕盒中。

（8）PBS洗3次，每次5min。

（9）滴加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)二抗，37℃，30min。

（10）PBS洗3次，每次5min。

（11）加酶底物顯色。顯微鏡下觀察控制呈色反應(yīng)，以結(jié)果清晰，背景無(wú)非特異性染色為度。

（12）自來(lái)水充分沖洗。

（13）蘇木素復(fù)染或不復(fù)染。

（14）梯度乙醇脫水、透明、封片。

★酶橋法

【基本原理】　用酶免疫動(dòng)物，制備高效價(jià)、特異性強(qiáng)的抗酶抗體，用二抗作橋，將抗酶抗體和特異性的第一抗體連接起來(lái)，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，形成酶－抗酶抗體－橋接二抗－特異抗體（一抗）復(fù)合物，最后經(jīng)過(guò)酶催化底物形成光鏡下可直接觀察的有色的產(chǎn)物，標(biāo)記出抗原的位置、含量。

【主要特點(diǎn)】　酶橋法是對(duì)免疫酶法的重大改進(jìn)，酶是通過(guò)免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合的，避免了間接法中共價(jià)連接對(duì)酶活性的影響，提高了方法的敏感性。酶橋法雖然克服酶標(biāo)記抗體法的缺點(diǎn)，較好地保護(hù)了抗體和酶的活性，也提高了敏感性，實(shí)際運(yùn)用中，游離酶的濃度難以準(zhǔn)確把握，而且由于組織中非特異性結(jié)合的酶難以去除，導(dǎo)致背景著色較重。

【染色步驟】

（1）～（6）同“直接法”。

（7）甩掉正常血清，滴加適當(dāng)稀釋度的一抗，37℃，30～60min或4℃過(guò)夜，置濕盒中。

（8）PBS洗3次，每次5min。

（9）加二抗，37℃，30min。

（10）PBS洗3次，每次5min。

（11）加抗酶抗體（三抗），37℃，30min，置濕盒中。

（12）PBS洗3次，每次5min。

（13）加酶溶液，37℃，30min，置濕盒中。

（14）PBS洗3次，每次5min。

（15）加酶底物顯色。顯微鏡下觀察控制呈色反應(yīng)，以結(jié)果清晰，背景無(wú)非特異性染色為度。

（16）自來(lái)水充分沖洗。

（17）蘇木素復(fù)染胞核或不復(fù)染。

（18）梯度乙醇脫水、透明、封片。

★PAP法

【基本原理】　PAP法是酶橋法等基礎(chǔ)之上建立的，基本原理與酶橋法相似。

【主要特點(diǎn)】　最大改進(jìn)是將酶和抗酶抗體制成復(fù)合物（PAP）代替了酶橋法中的抗酶抗體和隨后結(jié)合的酶，將這兩步合并為一步。這一改進(jìn)，不僅僅是簡(jiǎn)化步驟，而且最大限度地保存了抗體和酶的活性，優(yōu)化了兩者的比例，提高了靈敏度，解決了酶橋法中酶標(biāo)記的非特異性抗體與組織抗原結(jié)合，引起背景染色的問(wèn)題，背景著色淡。

【染色步驟】

（1）～（6）同直接法。

（7）甩掉正常血清，滴加適當(dāng)稀釋度的一抗，37℃1h或4℃過(guò)夜，置濕盒中。

（8）PBS洗3次，每次5min。

（9）加二抗（橋抗體，無(wú)生物素標(biāo)記），室溫或37℃，0．5～1h。

（10）PBS洗3次，每次5min。

（11）加PAP復(fù)合物（即酶－抗酶抗體復(fù)合物），37℃，0．5～1h。

（12）PBS洗3次，每次5min。

棬棻棾棭滴加棸灡棸椀棩斈斄斅灢棸灡棸棻棩斎棽斚棽棬棸灡棸椀旐旓旍棷斕棳旔斎椃灡棿的斣斅斢配制棭棳室溫顯色棻棸暙棽棸旐旈旑棳顯微鏡下觀察控制呈色反應(yīng)棳以結(jié)果清晰棳背景無(wú)非特異性染色為度暎棬棻棿棭自來(lái)水洗終止反應(yīng)暎棬棻椀棭梯度乙醇脫水暍透明暍封片暎曪雙斝斄斝法暰主要特點(diǎn)暱 雙斝斄斝法棳又稱(chēng)雙橋法棳是對(duì)斝斄斝法的改進(jìn)棳通過(guò)兩次連接橋抗體和斝斄斝棳在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了比斝斄斝法更多的酶分子棳可提高敏感性達(dá)棽棸暙椀棸倍暎但雙斝斄斝法步驟多暍需時(shí)長(zhǎng)棳在實(shí)際操作中棳也可能會(huì)導(dǎo)致非特異性放大暎

染色步驟

棬棻棭暙棬棻棽棭步同暟斝斄斝法暠暎棬棻棾棭重復(fù)滴加二抗棳但稀釋度是前次的棻倍棳棾椃曟棳棾棸旐旈旑棳置濕盒中暎棬棻棿棭斝斅斢洗棾次棳每次椀旐旈旑暎棬棻椀棭重復(fù)滴加斝斄斝復(fù)合物棳稀釋度也是前次的一倍棳棾椃曟棳棾棸旐旈旑棳置濕盒中暎棬棻椂棭斝斅斢洗棾次棳每次椀旐旈旑暎棬棻椃棭加酶底物顯色暎顯微鏡下觀察控制呈色反應(yīng)棳以結(jié)果清晰棳背景無(wú)非特異性染色為度暎

棬棻椄棭自來(lái)水充分沖洗暎

棬棻椆棭蘇木素復(fù)染胞核暎

棬棽棸棭梯度乙醇脫水暍透明暍封片暎

曪堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶法

暰主要特點(diǎn)暱 堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶棬斸旍旊斸旍旈旑斿旔旇旓旙旔旇斸旚斸旙斿斸旑旚旈斸旍旊斸旍旈旑斿旔旇旓旙旔旇斸旚斸旙斿棳斄斝斄斄斝棭法是在斝斄斝法的基礎(chǔ)上棳用斄斕斝替代斎斠斝進(jìn)行酶底物催化棳它們都屬于未標(biāo)記抗體橋聯(lián)法暎其主要優(yōu)點(diǎn)椇栙敏感性好棳不受組織中內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響和干擾椈栚在血暍骨髓暍脫落細(xì)胞涂片染色效果更好椈栛反應(yīng)穩(wěn)定棳著色清楚棳背景淡暎而且斄斝斄斄斝法避免了使用有致癌嫌疑斈斄斅顯色暎但本法用快紅或快藍(lán)顯色棳只能用水性膠封片棳而且切片保存時(shí)間較短棳一般只有數(shù)月即會(huì)褪色暎

暰染色步驟暱

棬棻棭暙棬椄棭同暟斝斄斝法暠暎

棬椆棭加斄斕斝標(biāo)記的二抗棳棾椃曟棳棾棸暙椂棸旐旈旑棳置濕盒中暎

棬棻棸棭斝斅斢洗棾次棳每次椀旐旈旑暎

棬棻棻棭加入斣斅斢棬內(nèi)含棻旐旐旓旍棷斕左旋咪唑棳椀旐旐旓旍棷斕斖旂斆旍棽棭阻斷內(nèi)源性堿性磷酸酶暎

棬棻棽棭滴加適當(dāng)稀釋的斄斝斄斄斝復(fù)合物棳棾椃曟棳棾棸旐旈旑暎

棬棻棾棭斝斅斢洗棾次棳每次棾旐旈旑暎

棬棻棿棭滴加斄斕斝底物溶液棳棾椃曟棳棻椀暙棾棸旐旈旑棳陽(yáng)性結(jié)果顯現(xiàn)清晰后流水沖洗暎

棬棻椀棭復(fù)染暍常規(guī)沖洗暍甘油明膠封片暎

曪抗生物素灢生物素免疫組織化學(xué)染色法

生物素棳即維生素?cái)葪c卵白素之間有高度的親和性棳是自然界中親和力最強(qiáng)的物質(zhì)之一暎人們最早注意到這一現(xiàn)象是發(fā)現(xiàn)在給動(dòng)物飼以大量雞蛋白后棳會(huì)引起暟維生素?cái)热狈ΠY暠暎

【基本原理】

生物素是一種小分子維生素，它與卵白素能相互牢固結(jié)合而不影響彼此生物活性，它們之間的親和性是抗原抗體的100萬(wàn)倍。到了20世紀(jì)70年代，人們又發(fā)現(xiàn)生物素可以和抗體交聯(lián)。

【主要特點(diǎn)】

1．親和素－生物素法（avidin－biotin　complex，ABC）　1981年美籍華人許世明利用生物素和卵白素之間高度親和的特點(diǎn)創(chuàng)建了親和素－生物素法（avidin－biotin　complex，ABC），其特點(diǎn)是用卵白素分別連接生物素標(biāo)記的二抗和生物素標(biāo)記的酶，而且以過(guò)氧化物酶為橋，連接于卵白素之間，交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成ABC復(fù)合物，極大地提高了敏感性，而且該方法特異性高、背景染色淡、方法簡(jiǎn)便，是目前最廣泛使用的免疫組織化學(xué)方法。

2．鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶聯(lián)結(jié)法（streptavidin－perosidase，SP）　在ABC法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，即用辣根過(guò)氧化物酶直接標(biāo)記鏈霉卵白素，用生物素標(biāo)記二抗，形成一抗－生物素化二抗－HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素復(fù)合物。與ABC法相比，SP法過(guò)氧化物酶直接與鏈霉卵白素相連，在原卵白素－生物素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物中沒(méi)有了生物素的中介連接，尤其是鏈霉卵白素不與某些組織中內(nèi)源性生物素結(jié)合，減少了背景著色，擴(kuò)大了使用范圍。目前SP法比ABC法應(yīng)用更加普遍。

【染色步驟】

1．ABC法

（1）切片脫蠟、梯度下降乙醇至水。

（2）PBS洗3次，每次5min。

（3）0．3%H2O2，37℃，10min，置濕盒中。

（4）PBS洗3次，每次5min。

（5）枸櫞酸緩沖液（pH　6．0）中煮沸（100℃，1min），自來(lái)水沖洗容器冷卻。

（6）PBS洗3次，每次5min。

（7）正常山羊血清封閉，室溫20min，甩掉多余的血清，不洗。

（8）滴加適當(dāng)稀釋的一抗，4℃過(guò)夜或者37℃，1h，濕盒中。

（9）PBS洗3次，每次5min。

（10）滴加生物素化二抗，37℃，1h，濕盒中。

（11）PBS洗3次，每次5min。

（12）加卵白素（A液）－生物素過(guò)氧化物酶（B液）復(fù)合物，A∶B為1∶1，稀釋50倍，37℃，1h，濕盒中。

（13）PBS洗3次，每次5min。

（14）0．05%DAB－0．01%H2O2（0．05mol／L的TBS配制），室溫顯色10～20min，顯微鏡下掌握染色程度。

（15）自來(lái)水洗終止反應(yīng)。

（16）常規(guī)脫水、透明、封片。

2．SP法

（1）切片脫蠟、水化。

（2）PBS洗3次，每次5min。

（3）0．3%H2O2，37℃，10min，置濕盒中。

（4）PBS洗3次，每次5min。

（5）枸櫞酸緩沖液（pH　6．0）中煮沸（100℃，1min），自來(lái)水沖洗容器冷卻。

（6）PBS洗3次，每次5min。

（7）正常山羊血清封閉，室溫20min。

（8）滴加一抗，4℃過(guò)夜或者37℃，1h。

（9）PBS洗3次，每次5min。

（10）滴加生物素化二抗，37℃，1h。

（11）PBS洗3次，每次5min。

（12）滴加鏈霉卵白素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物，稀釋1∶50，37℃，1h，濕盒中。

（13）DAB顯色同ABC法。

（14）自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，常規(guī)脫水、透明、封片。

★EnvisionTMSystem

本法是近幾年在國(guó)內(nèi)推廣使用的二步法免疫組化檢測(cè)方法。

【基本原理】　將多個(gè)抗鼠或抗兔IgG分子（二抗）與辣根過(guò)氧化物酶共同聚合在1個(gè)氨基酸骨架上，形成多聚體復(fù)合物，再與抗原抗體復(fù)合物中的第一抗體結(jié)合，經(jīng)DAB顯色即可完成染色。

【主要特點(diǎn)】　敏感、省時(shí)、方便、背景低。因不使用生物素分子，所以避免了內(nèi)源性生物素造成的非特異性背景著色。目前市面上見(jiàn)到的是PV二步法試劑盒，其中PV－6001試劑盒為羊抗兔IgG多聚體（即二抗來(lái)自山羊，一抗必須購(gòu)買(mǎi)來(lái)自兔的）；PV－6002試劑盒為羊抗小鼠IgG多聚體（即二抗來(lái)自羊，購(gòu)買(mǎi)一抗時(shí)必須是來(lái)自小鼠的）。

【染色步驟】

（1）切片準(zhǔn)備同前。

（2）加第一抗體、孵育、漂洗。

（3）加二抗－過(guò)氧化物酶聚合物，孵育、漂洗。

（4）DAB－H2O2顯色反應(yīng)同前；常規(guī)脫水、透明、封片。

★真空負(fù)壓LSAB（labeledstreptavidinbiotin）法

本法創(chuàng)立于1992年，其基本原理是各種物質(zhì)的分子在真空負(fù)壓的條件下，由于失重而飄游起來(lái)，從而增加了各物質(zhì)分子間的碰撞機(jī)會(huì)，加速了抗原抗體的結(jié)合，使反應(yīng)提前完成。實(shí)驗(yàn)證明，該法能夠提高染色效果，節(jié)省染色時(shí)間。