分子藥理學(xué)屬于一門新興學(xué)科，其與傳統(tǒng)藥理學(xué)的最大區(qū)別在于，它是從分子水平和基因表達(dá)的角度去闡釋藥物作用及其機(jī)制。生命科學(xué)的發(fā)展由宏觀到微觀，藥理學(xué)的發(fā)展也由整體水平、器官水平、組織水平深入到細(xì)胞水平和分子水平。近代藥理學(xué)的進(jìn)展，主要表現(xiàn)在受體理論、離子通道、自體活性物質(zhì)、信息傳遞、細(xì)胞因子等分子水平上的研究突破。分子藥理學(xué)是指其學(xué)科層次、水平上的科學(xué)性和先進(jìn)性達(dá)到“分子水平”，且又屬于“藥理學(xué)”范疇，分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的基礎(chǔ)知識(shí)貫穿其中。當(dāng)前，分子藥理學(xué)技術(shù)應(yīng)用的熱點(diǎn)主要集中在：藥物對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)；先導(dǎo)化合物活性的高通量篩選；應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)和鑒定藥靶；應(yīng)用RNAi技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)鑒定藥靶等。

（一）藥物對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)

主要技術(shù)有Northern印跡法、聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)、報(bào)告基因篩選技術(shù)。

1．Northern印跡法 繼分析DNA的Southern印跡法出現(xiàn)后，1977年Alwine等提出一種與此相類似的、用于分析細(xì)胞總RNA或含poly A尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交技術(shù)，這就是與Southern相對(duì)應(yīng)而定名的Northern印跡技術(shù)。這一技術(shù)自出現(xiàn)以來(lái)，已得到廣泛應(yīng)用，成為分析mRNA最為常用的經(jīng)典方法。與Southern印跡相似，Northern印跡也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來(lái)，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標(biāo)記的DNA或RNA探針，依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行放射自顯影（或化學(xué)顯影），以目標(biāo)RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強(qiáng)度可提示目標(biāo)RNA在所測(cè)樣品中的相對(duì)含量（即目標(biāo)RNA的豐度）。但與Southern印跡不同的是，總RNA不需要進(jìn)行酶切，即是以各個(gè)RNA分子的形式存在，可直接應(yīng)用于電泳；此外，由于堿性溶液可使RNA水解，因此不進(jìn)行堿變性，而是采用甲醛等進(jìn)行變性電泳。雖然Northern也可檢測(cè)目標(biāo)mRNA分子的大小，但更多的是用于檢測(cè)目的基因在組織細(xì)胞中有無(wú)表達(dá)及表達(dá)的水平如何。

2．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA片段高效擴(kuò)增的技術(shù)，可檢出微量靶序列。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。用于在體外將微量的目標(biāo)DNA大量擴(kuò)增，以便進(jìn)行分析。反應(yīng)體系：①樣品DNA。②引物（primer），是人工合成的一對(duì)寡核苷酸鏈（15～20個(gè)核苷酸），用于擴(kuò)增夾在雙引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)之間的區(qū)域。③4種dNTP。④Tag DNA聚合酶，是從一種嗜熱水生菌中分離出來(lái)的。此酶最適作用溫度為75～80℃，但短時(shí)間在95℃下不失活。⑤適宜的緩沖體系和適量的Mg2＋。PCR反應(yīng)的參數(shù)主要由以下幾部分組成。

（1）變性：在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對(duì)的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。變性不完全，往往使PCR失敗，因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量。一般變性溫度與時(shí)間為94℃，1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。?duì)于富含GC的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。

（2）退火：這是PCR的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度（Tm）從55～70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃，當(dāng)產(chǎn)物中包含有影響實(shí)驗(yàn)的非特異性擴(kuò)增帶時(shí)，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并，只用兩種溫度（例如用60℃和94℃）完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。

（3）延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃。實(shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開始，因?yàn)門aq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20～85℃，延伸反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短取決于目的序列的長(zhǎng)度和濃度。在一般反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb長(zhǎng)的DNA。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加，但對(duì)很低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間（10～30 min）的延伸反應(yīng)，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測(cè)序反應(yīng)尤為重要。

（4）循環(huán)次數(shù)：當(dāng)其他參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25～30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過(guò)多，會(huì)使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25～30輪循環(huán)擴(kuò)增后，反應(yīng)中Taq DNA聚合酶已經(jīng)不足，如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠，需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋103～105倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，擴(kuò)增水平可達(dá)109～1010。在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。

傳統(tǒng)的PCR方法需要對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。這種方法可以確定目的產(chǎn)物和競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物的大小，估算純度，計(jì)算條帶強(qiáng)度。然而，所用擴(kuò)增試劑和體系的變動(dòng)會(huì)造成擴(kuò)增的終產(chǎn)物的重復(fù)性有較大的變動(dòng)，成為這種方法的主要弊端。目前多采用實(shí)時(shí)PCR原理（real time PCR），其目的在于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可重復(fù)性的定量。由于擴(kuò)增過(guò)程的指數(shù)期提供給我們最有用的，可重復(fù)的數(shù)據(jù)。在起始的目的DNA量與循環(huán)過(guò)程的指數(shù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物量之間存在著定量關(guān)系。這正是實(shí)時(shí)擴(kuò)增的基礎(chǔ)。隨著DNA內(nèi)嵌染料和探針特異性化學(xué)的發(fā)展，實(shí)時(shí)探測(cè)量子學(xué)的跳躍發(fā)展推動(dòng)了對(duì)擴(kuò)增過(guò)程的研究進(jìn)展。如今的實(shí)時(shí)設(shè)備由熒光讀數(shù)計(jì)和熱循環(huán)儀組成，用來(lái)監(jiān)測(cè)循環(huán)過(guò)程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過(guò)開發(fā)的實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對(duì)于循環(huán)數(shù)的圖表。在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中至少收集一次熒光數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)控。使用者能夠根據(jù)一個(gè)一個(gè)的循環(huán)知道哪個(gè)樣品正在擴(kuò)增。這些即時(shí)的數(shù)據(jù)允許使用者看清楚各個(gè)樣本相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是如何擴(kuò)增的。使用者不僅能在擴(kuò)增過(guò)程中監(jiān)督整個(gè)反應(yīng)，還可以根據(jù)反饋的信息來(lái)優(yōu)化相應(yīng)程序。因此增加了敏感性、特異性和有效性。

3．報(bào)告基因篩選技術(shù) 報(bào)告基因（reporter gene）是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，此類基因所表達(dá)的蛋白活性已被確認(rèn)。報(bào)告基因篩選模型是利用基因工程技術(shù)將疾病相關(guān)基因與報(bào)告基因相嵌合，導(dǎo)入模型細(xì)胞，觀察藥物對(duì)該基因表達(dá)的影響來(lái)篩選有效藥物。隨著生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的孤兒受體被發(fā)現(xiàn)，這些受體有可能成為新的藥物篩選靶點(diǎn)，對(duì)于這些受體的配體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的了解都有賴于報(bào)告基因篩選模型。

（二）先導(dǎo)化合物活性的高通量篩選

當(dāng)今的藥物合成研究領(lǐng)域利用組合化學(xué)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)的模式，大大加速了候選藥物的合成速度，急劇增加了合成化合物的數(shù)目，加上中藥本身蘊(yùn)涵的龐大天然化合物庫(kù)，藥物活性篩選的速度與規(guī)模成為制約新藥研發(fā)的“瓶頸”環(huán)節(jié)，因此對(duì)高通量藥物篩選的研究愈顯重要。

1．高通量藥物篩選技術(shù) 是以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，采用自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，再通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

（1）高通量藥物篩選：一般要經(jīng)過(guò)藥物的初篩和復(fù)篩、深入篩選、確證篩選等過(guò)程。藥物的初篩和復(fù)篩是在分子、細(xì)胞水平上篩選樣品，證明某一樣品對(duì)該靶點(diǎn)具有藥理活性（或親和力），在初篩中發(fā)現(xiàn)的活性化合物，可進(jìn)入復(fù)篩程序。復(fù)篩時(shí)將選擇出的具有活性的化合物，稀釋成系列濃度，用初篩時(shí)采用的同一模型進(jìn)行復(fù)篩，闡明其對(duì)該靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)、作用強(qiáng)度和量效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)活性化合物。

（2）深入篩選：是在初篩和復(fù)篩的基礎(chǔ)上得到的活性化合物。采用與初篩不同但相關(guān)的分子、細(xì)胞毒性以及其他性質(zhì)，結(jié)合活性化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)的性質(zhì)特點(diǎn)，進(jìn)行綜合分析，確定在結(jié)構(gòu)和作用方面具有新穎性和開發(fā)價(jià)值的化合物（樣品），作為先導(dǎo)化合物（lead compound）；同時(shí)也可結(jié)合組織、器官或整體動(dòng)物模型，證明其藥理作用，經(jīng)過(guò)深入篩選，為比較全面地評(píng)價(jià)活性化合物的藥用價(jià)值提供更充分的實(shí)驗(yàn)資料。

（3）結(jié)構(gòu)優(yōu)化：獲得先導(dǎo)化合物以后，根據(jù)實(shí)際情況一般需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化（根據(jù)資料也可以直接作為藥物候選化合物進(jìn)行開發(fā)），即進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)的改造，以便得到活性更高、缺點(diǎn)更少的活性物質(zhì)。結(jié)構(gòu)優(yōu)化手段是經(jīng)過(guò)分子設(shè)計(jì)進(jìn)行多種衍生物的合成，組合化學(xué)技術(shù)為結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了強(qiáng)有力的手段。結(jié)構(gòu)優(yōu)化后的化合物需要通過(guò)復(fù)篩過(guò)程，以便尋找到高效的新化合物。

（4）確證篩選：是對(duì)深入篩選獲得的先導(dǎo)化合物或優(yōu)化后被選定的活性最好的化合物進(jìn)行更深入廣泛的研究，其內(nèi)容包括藥理作用、藥物代謝過(guò)程、一般毒性等多方面的篩選，以確定其開發(fā)前景。對(duì)符合藥物要求的樣品，確定為藥物候選化合物（candidate compounds），進(jìn)入開發(fā)研究程序，即臨床前研究，為臨床研究準(zhǔn)備必要的資料。

2．高通量藥物篩選的特點(diǎn) 由于高通量藥物篩選模型中分子、細(xì)胞水平上的相互作用，只有采用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法才能以可視化的形式反映出來(lái)，因此高通量的檢測(cè)方法是實(shí)現(xiàn)高通量藥物篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。針對(duì)高通量藥物篩選的特殊要求，一種理想的分析檢測(cè)技術(shù)應(yīng)具備下列特點(diǎn)：高通量；原位直接檢測(cè)；檢測(cè)成本低；靶點(diǎn)無(wú)需標(biāo)記或修飾；精準(zhǔn)地反映篩選結(jié)果，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果；適合初次篩選、深入篩選和確證篩選；適合受體、酶、離子通道、細(xì)胞等多種篩選模型。應(yīng)該說(shuō)，到目前為止并沒(méi)有一種檢測(cè)技術(shù)能完全具備上述特征。

3．光學(xué)檢測(cè)技術(shù) 高通量藥物篩選中的光學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有無(wú)需分離即可實(shí)現(xiàn)原位檢測(cè)、篩選通量高、檢測(cè)成本低、檢測(cè)儀器成熟的突出優(yōu)勢(shì)，只是篩選系統(tǒng)本身就具有理想的光學(xué)檢測(cè)信號(hào)的機(jī)會(huì)并不多，因此在高通量藥物篩選中往往要結(jié)合標(biāo)記技術(shù)以擴(kuò)展光學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用范圍。這種光學(xué)標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)靈活多樣，已成為高通量藥物篩選中應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)方法之一。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)了生物活性分子鍵合標(biāo)記分子后，可能引起構(gòu)象變化，活性結(jié)合位點(diǎn)的覆蓋和空間阻礙等一系列不利因素，易造成藥物篩選中出現(xiàn)假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果。正是由于標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)在應(yīng)用中存在著諸多不足，近年來(lái)與之相對(duì)應(yīng)的一種稱為非標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)（label-free technologies）的概念逐漸興起與流行，迅速成為高通量藥物篩選研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

（1）非標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)：其所涵蓋的并不僅限于光學(xué)傳感器檢測(cè)技術(shù)，其他的一些檢測(cè)技術(shù)，如質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)、膜片鉗電極陣列技術(shù)、熱分析檢測(cè)技術(shù)等實(shí)際上都具有非標(biāo)記檢測(cè)的特征。與光學(xué)檢測(cè)技術(shù)相比較而言，這些檢測(cè)技術(shù)能夠提供豐富的樣品與靶點(diǎn)作用信息，準(zhǔn)確地反映篩選結(jié)果，避免了假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，其優(yōu)勢(shì)已不僅是非標(biāo)記這一點(diǎn)。

（2）解析生物大分子結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)手段：如核磁共振技術(shù)、X射線晶體衍射技術(shù)、電子顯微鏡技術(shù)，在高通量藥物篩選中的應(yīng)用價(jià)值也逐漸受到研究者的關(guān)注。非標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)雖然還受到檢測(cè)成本、檢測(cè)通量等方面的限制，目前在高通量藥物篩選中應(yīng)用范圍也還沒(méi)有光學(xué)檢測(cè)技術(shù)那么廣泛，但在一些篩選模型應(yīng)用中已經(jīng)體現(xiàn)出了諸多優(yōu)勢(shì)，完善、發(fā)展這些檢測(cè)技術(shù)已被視為未來(lái)高通量藥物篩選研究的重要發(fā)展方向。而這些技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用，必將表明合理運(yùn)用現(xiàn)代藥物分析技術(shù)的重要性，在推動(dòng)高通量藥物篩選技術(shù)發(fā)展乃至創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)中起著關(guān)鍵作用。

4．發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)物的新方法 近年來(lái)，隨著藥物化學(xué)及相關(guān)研究領(lǐng)域的發(fā)展，藥物研究新技術(shù)新方法層出不窮，在大量的實(shí)踐過(guò)程中，已經(jīng)總結(jié)了很多先導(dǎo)物發(fā)現(xiàn)的方法。例如，基于組合化學(xué)和高通量篩選的藥物發(fā)現(xiàn)方法等，這些方法以及理論對(duì)新藥的研發(fā)起到了巨大的推動(dòng)作用。但是，盡管具有較好生物活性的苗頭化合物和先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)速度明顯加快，新藥的整體研發(fā)效率依然偏低，每年上市新藥的數(shù)目并沒(méi)有明顯的增加（每年平均20～30個(gè)）。因此，怎樣提高苗頭化合物的成藥概率，提高先導(dǎo)化合物的研發(fā)效率，成為新藥研究中的“瓶頸”問(wèn)題。造成這一問(wèn)題的主要原因是先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)方法的盲目應(yīng)用：藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)通常建立了巨大的化合物庫(kù)，利用高通量篩選方法對(duì)化合物庫(kù)中的分子進(jìn)行快速的生物活性初步篩選從而發(fā)現(xiàn)苗頭化合物，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化成為先導(dǎo)化合物。這種新藥發(fā)現(xiàn)模式雖然在初期加速了新藥研發(fā)的速度，但是由于化合物庫(kù)中的分子往往不具備結(jié)構(gòu)的多樣性，而且經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾后相對(duì)分子質(zhì)量較大難以兼顧類藥性質(zhì)，導(dǎo)致先導(dǎo)化合物在藥物開發(fā)過(guò)程中由于物化性質(zhì)、藥物代謝性質(zhì)以及安全性等方面的問(wèn)題而被迫中止。為擺脫新藥研究的困境，藥物化學(xué)家們發(fā)展了很多優(yōu)化先導(dǎo)化合物新的方法：如藥效團(tuán)與分子骨架遷越方法、基于系統(tǒng)生物學(xué)以及電子生物學(xué)的藥物發(fā)現(xiàn)方法，以及基于分子片段的藥物發(fā)現(xiàn)的方法等，這些方法的應(yīng)用提高了先導(dǎo)化合物的品質(zhì)，使其成藥的概率提高。

（三）應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)和鑒定藥靶

1．蛋白質(zhì)組 這一概念是1995年由澳大利亞的Wilkins和Williams率先提出的。其含義是指一個(gè)基因組、一個(gè)細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)是一衍生概念，宗旨為通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)豐度和性質(zhì)變化的考察。應(yīng)能夠揭示蛋白質(zhì)的活動(dòng)規(guī)律。解釋基因調(diào)節(jié)機(jī)制，從而可透視到生命現(xiàn)象的本質(zhì)。將其應(yīng)用于新藥研究中，可通過(guò)對(duì)疾病與正常細(xì)胞中蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)一些疾病相關(guān)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可以成為藥物篩選的作用靶點(diǎn)或是相關(guān)疾病的分子標(biāo)志物。

2．特定功能蛋白異常 通常疾病伴隨特定功能蛋白異常。決定個(gè)體生物性狀、代謝特征和病理狀況的特殊功能蛋白是潛在的藥靶?；虮磉_(dá)及蛋白翻譯后加工受到基因之間與蛋白之間的作用、代謝狀態(tài)和環(huán)境等的影響。功能蛋白的表達(dá)異常和調(diào)節(jié)異常通常是疾病發(fā)生的分子標(biāo)志。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究特定時(shí)空細(xì)胞、組織等所含蛋白的表達(dá)譜的有效手段，也是尋找疾病分子標(biāo)記和藥靶的重要方法。蛋白質(zhì)組學(xué)研究藥靶通常采用比較蛋白質(zhì)組分析的方法，對(duì)于表型發(fā)生改變細(xì)胞內(nèi)的蛋白進(jìn)行比較分析。例如，通過(guò)比較生理與病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)的區(qū)別、相應(yīng)疾患者群與正常人群在對(duì)應(yīng)病理組織／器官內(nèi)蛋白質(zhì)的差別，從而探索潛在的藥靶。利用該策略發(fā)現(xiàn)人腸上皮細(xì)胞中“細(xì)胞分裂素”可作為免疫疾病治療的靶標(biāo)，肺上皮細(xì)胞中的“轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β”成為肺病治療的潛在靶標(biāo)。同樣，分析生長(zhǎng)因子、中藥等候選成分作用后引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變，也有助于尋找到藥物的作用靶點(diǎn)。如對(duì)巴豆制劑作用下的胃腸道組織蛋白與未使用巴豆制劑作用的胃腸道組織蛋白進(jìn)行比較分析，可獲得巴豆作用于平滑肌的靶蛋白相關(guān)信息，再經(jīng)蛋白測(cè)序和鑒定，有望發(fā)現(xiàn)巴豆促進(jìn)胃腸動(dòng)力作用的關(guān)鍵蛋白成為新的藥靶。

3．電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用 蛋白質(zhì)組學(xué)最經(jīng)典的技術(shù)路線為電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用。這種方法適用于大多數(shù)樣本，包括細(xì)胞（如原代培養(yǎng)細(xì)胞或各種細(xì)胞系）、組織（如肝臟、腦、腎等）、體液（如血清、腦脊液、尿液）等。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通常包含3組樣品：正常對(duì)照樣品、疾病模型樣品以及藥物處置樣品。

（1）疾病模型：不論細(xì)胞模型還是整體動(dòng)物模型，都應(yīng)該選擇與臨床疾病病理生理和發(fā)病機(jī)制相近或類似的模型。將這些樣品根據(jù)需要制備總蛋白、膜蛋白、核蛋白或是富集糖蛋白等，然后，通過(guò)除鹽、除核酸或去除白蛋白等處理減少對(duì)電泳有干擾的物質(zhì)。在同樣條件下制備和處理后的蛋白質(zhì)樣品在同樣條件下通過(guò)一維電泳或二維電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）進(jìn)行分離。

（2）染色：電泳后對(duì)凝膠進(jìn)行染色，常用的方法如考馬斯亮藍(lán)染色、硝酸銀染色、銀藍(lán)染色和熒光染色。銀藍(lán)染色是一種改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)染色方法，靈敏度明顯高于普通考馬斯亮藍(lán)染色，而比硝酸銀染色法低，但操作要求不高，染色條件亦容易控制，成本相對(duì)較低，質(zhì)譜兼容性好，它的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

（3）蛋白質(zhì)斑點(diǎn)成像和定量分析：凝膠染色后利用凝膠成像系統(tǒng)和專門的分析軟件對(duì)凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行成像和定量分析，并且對(duì)不同組別相同位置差異最大的斑點(diǎn)或感興趣的斑點(diǎn)進(jìn)行精確切取。然后對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行膠內(nèi)酶切，利用胰蛋白酶等蛋白酶將凝膠內(nèi)的蛋白水解成為肽段，得到的肽段混合物在生物質(zhì)譜系統(tǒng)中進(jìn)行分析，最終得到蛋白質(zhì)肽段的相關(guān)數(shù)據(jù)。將這些數(shù)據(jù)和已有的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，可以獲得蛋白質(zhì)的相關(guān)生物信息（相匹配的蛋白質(zhì)名稱、分子量、等電點(diǎn)等），從而發(fā)現(xiàn)藥物作用的潛在靶點(diǎn)或與藥物作用密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。

（4）驗(yàn)證與探討：通過(guò)Western blot、免疫組織化學(xué)等其他方法對(duì)得到的蛋白質(zhì)與藥物作用的關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證與探討，進(jìn)一步確定其關(guān)聯(lián)性。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后，可以得到藥物作用的潛在靶點(diǎn)或藥物作用的生物標(biāo)記物。針對(duì)得到的藥物靶點(diǎn)，結(jié)合蛋白質(zhì)芯片、酵母雙雜交、噬菌體展示等技術(shù)，可以對(duì)與該靶點(diǎn)相關(guān)的具體藥物作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4．應(yīng)用前景 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，交叉形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，是各項(xiàng)生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。從先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)、靶點(diǎn)的尋找與確認(rèn)，到藥物療效和毒性的評(píng)價(jià)，最終到臨床個(gè)體化給藥的實(shí)現(xiàn)，都是蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)揮技術(shù)的舞臺(tái)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為新藥研發(fā)提供了新的思路，無(wú)疑將對(duì)藥物研究起到強(qiáng)大的推動(dòng)作用，將有良好的應(yīng)用前景。

（四）應(yīng)用RNAi技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)鑒定藥靶

較低濃度雙鏈RNA可使靶基因不能表達(dá)出蛋白產(chǎn)物。因此，用RNAi降低候選基因的表達(dá)，可觀察并檢測(cè)細(xì)胞的表型和生理活動(dòng)的變化；同時(shí)，用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)增高對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)可觀察基因產(chǎn)物的正向效應(yīng)。兩種方案聯(lián)用可快速探索該基因的功能，是當(dāng)前確定藥靶的關(guān)鍵技術(shù)之一。此兩種技術(shù)的建立和發(fā)展，顯著加快了藥靶篩選與確認(rèn)。但是，此類法主要用于對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物具有很快響應(yīng)的細(xì)胞表型指標(biāo)進(jìn)行篩選，不適用于需要長(zhǎng)時(shí)間積累才能表現(xiàn)效應(yīng)的基因和對(duì)應(yīng)產(chǎn)物的分析。