維持蛋白質(zhì)特定空間構(gòu)象的因素包括：氫鍵、鹽鍵、疏水作用、金屬配位鍵和二巰鍵等，分離純化蛋白質(zhì)的靶點(diǎn)正是這些因素。蛋白質(zhì)分離純化的方法主要有以溶解度為基礎(chǔ)的分離方法，如鹽析、有機(jī)溶劑分級(jí)、萃取、結(jié)晶等；以靜電相互作用為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)的分離方法，如電泳、等點(diǎn)聚焦、離子交換層析和層析聚焦技術(shù)等；以分子大小為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分離方法，如超離心、凝膠過(guò)濾、超濾等；以疏水作用為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分離方法，如疏水層析、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、染料結(jié)合層析等；以生物活性為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分離方法；以配位鍵和二巰鍵為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分離方法等。下面介紹幾種常用的蛋白質(zhì)分離方法。

（一）鹽析

蛋白質(zhì)在水溶液中以兩性電解質(zhì)的形式存在，蛋白質(zhì)分子表面有一層溶劑化的水分子。當(dāng)溶液中的離子強(qiáng)度比較低的時(shí)候，蛋白質(zhì)的溶解度會(huì)隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象叫做“鹽溶”（salting in）；當(dāng)溶液中的離子強(qiáng)度比較高的時(shí)候，幾乎所有的蛋白質(zhì)溶解度都會(huì)隨著鹽濃度的增加而降低，更多的水分子從蛋白質(zhì)表面轉(zhuǎn)移到離子表面，使蛋白質(zhì)分子相互作用的機(jī)會(huì)增多，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的相互作用，使蛋白質(zhì)沉淀，這種現(xiàn)象叫做“鹽析”（salting out）。一定的鹽濃度下，每種蛋白質(zhì)都有一個(gè)不同的特異溶解度。這樣，如果將溶液中鹽的濃度調(diào)到某一值時(shí)，將有一組溶解度接近的蛋白質(zhì)以沉淀的形式被鹽析出來(lái)。經(jīng)過(guò)大量實(shí)踐比較，人們發(fā)現(xiàn)利用硫酸銨進(jìn)行這種鹽析時(shí)，效果最好。鹽析一般用于對(duì)細(xì)胞抽提液的粗提純。具體操作時(shí)，一般通過(guò)逐漸增加硫酸銨的濃度，并獲得每一濃度下的沉淀，收集含有目標(biāo)蛋白的那些沉淀，進(jìn)行再溶解和透析后做進(jìn)一步的純化（圖6-3）。

（二）離子交換柱層析

目前蛋白質(zhì)化學(xué)中使用最廣的分離方法之一是離子交換柱層析。其原理是利用物質(zhì)的電荷和層析載體的電荷間的相互作用，達(dá)到分離純化的目的。離子交換柱層析利用的是表面被帶有正或負(fù)電荷基團(tuán)修飾過(guò)的樹脂均勻組裝成的柱子。在一特定的pH條件下，某蛋白混合液體系中，每一種蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷的凈值是不同的。這樣，當(dāng)將蛋白混合液（所含鹽的濃度不能高）流經(jīng)在同樣pH條件下也帶電的樹脂層析柱時(shí)，其中的部分蛋白質(zhì)分子將不與樹脂顆粒結(jié)合（如果在給定pH條件下蛋白與樹脂都帶相同電荷或蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零的話），而直接穿過(guò)層析柱跑出來(lái)；另外一部分表面所帶凈電荷與樹脂顆粒表面所帶電荷相反的蛋白質(zhì)就被結(jié)合在樹脂上而停止前進(jìn)了。因?yàn)椴煌鞍踪|(zhì)所帶電荷的凈值是不同的，所以每一種蛋白質(zhì)結(jié)合在樹脂顆粒上的緊密程度也是有差異的。等到不結(jié)合的蛋白質(zhì)全部跑出柱子（這一步需要一定的時(shí)間）、結(jié)合的蛋白質(zhì)已經(jīng)很好地結(jié)合了之后，如果再用鹽濃度逐漸提高的溶液進(jìn)行洗脫（elute）的話，結(jié)合在樹脂顆粒上的蛋白質(zhì)分子將根據(jù)各自結(jié)合的緊密程度依次分批地、在不同的鹽濃度下被鹽分子中與蛋白質(zhì)所帶靜電荷相同的離子交換（和洗脫）下來(lái)：結(jié)合最松的最先被交換下來(lái)，結(jié)合最緊的最后被交換下來(lái)。

根據(jù)樹脂表面所帶電荷的不同，離子交換層析可分為兩類。一類是樹脂顆粒表面帶正電荷，這類樹脂可以結(jié)合帶負(fù)電的蛋白質(zhì)分子，結(jié)合之后的蛋白質(zhì)分子被鹽中的陰離子交換下來(lái)，這類離子交換層析稱為陰離子交換層析（anion-exchange chromatography）；另一類正好相反，樹脂顆粒表面帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)，這類層析被稱為陽(yáng)離子交換層析（cationexchange chromatography）。

離子交換層析也有濃縮樣本的作用，這種層析基本適用于親水性的蛋白質(zhì)的分離，由于從離子交換層析所選用的樹脂類型以及樣本洗脫的條件，可以得出樣本帶電行為的一些信息，再者，離子交換樹脂價(jià)格低廉，因此廣泛用于蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)的制備（圖6-4）。

（三）凝膠過(guò)濾層析

圖6-3　鹽析方法

圖6-4　離子交換柱層析方法

圖6-5　凝膠過(guò)濾層析方法

凝膠過(guò)濾層析也稱為體積排阻層析或分子篩層析（圖6-5）。它依據(jù)的是多孔的載體對(duì)不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同，從而對(duì)混合物進(jìn)行分離。分離蛋白質(zhì)混合溶液的凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)天然（未經(jīng)變性）蛋白質(zhì)分子之間大?。ㄇ蛐蔚鞍椎闹睆剑┑牟町惗M(jìn)行分離的一種方法。主要利用的是用聚丙烯酰胺、葡聚糖或瓊脂糖等制備的具有一定孔徑的惰性有孔微珠。當(dāng)?shù)鞍谆旌弦毫鹘?jīng)由這樣的微珠組裝而成的柱子的時(shí)候，那些直徑大于微珠孔徑的蛋白質(zhì)分子將被排除在微珠上的小孔之外，而從微珠之間往下流；那些直徑比微珠孔徑小的蛋白質(zhì)分子將可以進(jìn)入這些小孔，并逗留一些時(shí)間。這樣，蛋白分子的直徑越大，“跑”得就越快，直徑越小，“跑”得就越慢?；谝陨系奶卣?，這種層析技術(shù)被稱為排阻層析（size-exclusion chromatography）或凝膠過(guò)濾層析（gel filtration chromatography）。

凝膠過(guò)濾最大的不足之處是，整個(gè)過(guò)程中樣本非但不能濃縮，反而不斷地在稀釋，同時(shí)上樣量又不能太大，否則分辨率變差。為此，進(jìn)行凝膠過(guò)濾的樣本的濃度越大越好。

（四）親和層析

幾乎所有的蛋白質(zhì)都具有其特定的生物功能，因此可將和蛋白質(zhì)相互作用的分子作為配基，固定在載體上，就可以通過(guò)親和作用對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行特異的非常有效的分離。能夠與目標(biāo)蛋白特異結(jié)合的配基分子通過(guò)共價(jià)鍵被固定在固體微珠上，當(dāng)?shù)鞍谆旌弦捍┻^(guò)用這樣的微珠組裝而成的柱子的時(shí)候，只有目標(biāo)蛋白會(huì)結(jié)合在微珠表面而停止前進(jìn)，所有其他蛋白都會(huì)很快從柱子底部流出。等雜蛋白全部流出之后，再通過(guò)一定的盡可能溫和的手段將目標(biāo)蛋白從柱子中洗脫下來(lái)。如果這種配基與蛋白的相互作用是高效特異的，只需過(guò)一次這樣的親和層析柱就可把目標(biāo)蛋白從含有成千上萬(wàn)種不同蛋白的混合液中分離出來(lái)。能夠用作親和層析的配基包括酶的底物、抗體、DNA片段以及其他能與蛋白特異結(jié)合的任何可固定在固體顆粒上的大小分子。

親和層析最大的特點(diǎn)是高效簡(jiǎn)便，一旦固定化配基制備后，使用非常方便，通常情況下，只要在上樣后洗去雜質(zhì)，就可將所要的物質(zhì)解吸下來(lái)，而且所得的物質(zhì)具有較高的純度。親和層析的過(guò)程也是高度濃縮的過(guò)程（圖6-6）。親和層析還有另外兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，是其他分離方法所不能比擬的：一是可以從樣本中除去大量的雜質(zhì)，產(chǎn)率較高地獲得少量的物質(zhì)；二是可以在活性物質(zhì)中除去理化性質(zhì)幾乎完全相同的但已失活了的“雜質(zhì)”，這一點(diǎn)對(duì)提高酶或其他分子的比活特別有用。

圖6-6　親和層析方法