消毒監(jiān)測常使用到標(biāo)準(zhǔn)試驗芽孢菌株，有條件的醫(yī)院或防疫部門可以自己制備細(xì)菌芽孢，現(xiàn)以枯草桿菌黑色變種（ATCC　9372）芽孢為例介紹培養(yǎng)方法。

（一）物品準(zhǔn)備

1.培養(yǎng)液　普通營養(yǎng)肉湯，處方及制備方法可參考附錄A。普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液，處方及制備方法可參考附錄A。

2.無菌器材　各種規(guī)格的吸管、試管、L棒、接種環(huán)、無菌平皿、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液羅氏瓶、帶玻璃珠的三角燒瓶等無菌室用品。

3.必需的設(shè)備　冰箱、培養(yǎng)用恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、顯微鏡等。

（二）接種培養(yǎng)

1.分離純化培養(yǎng)

（1）接種增菌培養(yǎng)：取標(biāo)準(zhǔn)凍干菌種管，用碘酒和乙醇消毒菌種管尖端，無菌條件下打開菌種管用毛細(xì)管吸取少量營養(yǎng)肉湯注入菌種管內(nèi)融化凍干菌種，取出少量接種到無菌肉湯管內(nèi)。

（2）肉湯增菌：于37℃（嗜熱脂肪桿菌為56℃）溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，為第1代增菌肉湯培養(yǎng)物。

（3）分離接種純培養(yǎng)：用接種環(huán)取肉湯培養(yǎng)物在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離，于37℃（嗜熱脂肪桿菌為56℃）培養(yǎng)24h，生長形成有單個菌落，此為第2代培養(yǎng)物。

（4）制備接種菌懸液：用無菌接種環(huán)選取典型菌落接種到營養(yǎng)肉湯管內(nèi)（視需要可接種數(shù)管），置于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，此為第3代增菌液。

2.培養(yǎng)芽孢

（1）接種羅氏瓶：取第3代增菌液接種到營養(yǎng)瓊脂（嗜熱脂肪桿菌芽孢培養(yǎng)液內(nèi)尚需要加入特殊營養(yǎng)素及鈣鎂離子等）培養(yǎng)液上（平板或羅氏瓶），讓菌液能均勻漫過培養(yǎng)液所有表面，平放10min以上吸出多余的菌液，置于37℃（嗜熱脂肪桿菌為56℃）溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～5d。

（2）染色鏡檢：檢查細(xì)菌芽孢形成率。取少許菌苔做玻璃片涂片，用芽孢染色法（孔雀綠染色芽孢顯綠色）染色，于顯微鏡下檢查芽孢形成率能達(dá)到90%以上即可收取。

（3）收取芽孢：①向每個培養(yǎng)皿內(nèi)加入10ml無菌蒸餾水（羅氏瓶需要加入20ml），用滅菌的L棒輕輕刮下菌苔，然后用吸管將其吸入到無菌三角瓶內(nèi)。②溶菌斷鏈。將三角瓶內(nèi)芽孢液振搖5min，置于45℃水浴中24h，然后用4層無菌紗布過濾芽孢液除去瓊脂殘渣。

（4）離心清洗：將過濾后的芽孢液分裝在無菌離心管內(nèi)加蓋，置于離心機(jī)內(nèi)以3　000r／min，離心30min，棄去上清液，再加入無菌蒸餾水重新懸浮離心，如此反復(fù)離心3次，最后再加入無菌蒸餾水懸浮起來即成為芽孢液，移入帶玻璃珠的三角瓶內(nèi)。

（5）滅活繁殖體：①加熱滅活法。將帶玻璃珠芽孢液三角瓶置于80℃或60℃水浴中滅活10min或30min，嗜熱脂肪桿菌芽孢可用100℃水浴滅活5min，殺滅繁殖體。冷卻后放入4℃冰箱放置1周，再重新按上述方法離心清洗3次，然后重新用無菌蒸餾水將離心沉淀的細(xì)菌芽孢制成芽孢懸液。對芽孢懸液做活菌計數(shù)，放入帶玻璃珠的無菌玻璃瓶內(nèi)，標(biāo)明含菌量、制備日期、細(xì)菌名稱等，保存4℃冰箱內(nèi)備用。②酶溶滅活處理法。將收獲并經(jīng)離心清洗后的細(xì)菌芽孢用0.03mol／L PBS制成芽孢懸液，然后加入溶菌酶進(jìn)行消化作用，再經(jīng)3　000r／min，離心30min。對細(xì)菌芽孢沉淀物用無菌蒸餾水反復(fù)離心清洗3次，然后將沉淀物用無菌蒸餾水制成芽孢懸液，按上述方法進(jìn)行活菌計數(shù)，標(biāo)記儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>