丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一類具有包膜結(jié)構(gòu)的單正鏈RNA病毒。病毒體呈球形，大小為40～60nm。為黃病毒科病毒。因全病毒至今尚未分離成功，對(duì)其形態(tài)及物理特性無法確切描述。HCV引起的損害是由于免疫反應(yīng)所致，但病毒本身致病性也不排除，目前尚不完全清楚。HCV對(duì)理化消毒均敏感，60℃10h或100℃5min煮沸或高壓蒸汽、過氧乙酸浸泡、高氯消毒劑浸泡、甲醛熏蒸均可使病毒RNA失活。

1989年，美國(guó)學(xué)者自10　000ml的HCV陽性黑猩猩血漿中超速離心收集病毒，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，克隆入載體，首次獲得約70%的HCV基因，并利用表達(dá)的蛋白，建立了特異的抗體檢測(cè)系統(tǒng)。此后，學(xué)者們又克隆了來自丙肝患者血清的HCV毒株，并獲得了全基因組序列。HCV基因組為一條單正鏈線狀RNA，長(zhǎng)度約9．4kb，由9個(gè)基因區(qū)組成：自5′端開始，依次為5′端非編碼區(qū)、核心蛋白區(qū)（core，C區(qū)）、包膜蛋白-1區(qū)（E1區(qū)）、包膜蛋白-2／非結(jié)構(gòu)蛋白-1區(qū)（E2／NS1區(qū)）、非結(jié)構(gòu)蛋白-2區(qū)（NS2區(qū)）、非結(jié)構(gòu)蛋白-3區(qū)（NS3區(qū)）、非結(jié)構(gòu)蛋白-4區(qū)（NS4區(qū)）、非結(jié)構(gòu)蛋白-5區(qū)（NS5區(qū)）和3′端非編碼區(qū)。其中C區(qū)和E1區(qū)為病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，即編碼病毒的衣殼及包膜蛋白。5′端非編碼區(qū)的核苷酸序列保守性強(qiáng)，可用于基因檢測(cè)診斷。E1、E2／NS1區(qū)基因容易發(fā)生變異，使包膜蛋白的抗原性改變而不被原有的抗包膜抗體識(shí)別，使病毒得以持續(xù)存在，這是HCV易引起慢性丙型肝炎的原因之一（圖5-8）。C、NS3、SN4及NS5區(qū)基因的表達(dá)產(chǎn)物，可用于檢測(cè)患者血清中的抗-HCV。

圖5-8　HCV基因組結(jié)構(gòu)

HCV的另一分子生物學(xué)特點(diǎn)是有自發(fā)產(chǎn)生高變異株的能力，極易變異。由于高度的核苷酸變異，至少可分為6種不同的HCV基因型，用阿拉伯?dāng)?shù)字1～6表示。其中1型為全球分布，占感染者70%以上。亞型用小寫英文字母表示，常見的有1a、1b、2b、3c等。這表明只有在65%的丙肝中存在基因序列的同源性。在基因型中，77%～79%序列同源性的亞型和88%以上的病毒變異體可被區(qū)分。基因型在不同的地理分布模式上有不同特征。

1．基因型1a、1b在美國(guó)、西歐和南美占優(yōu)勢(shì)；基因型3a通常發(fā)現(xiàn)在較年輕的個(gè)體并且是常常通過靜脈亂用藥物的人，而基因型1b則更多地出現(xiàn)在老年人身上。

2．基因型1b、2a和2b大多在日本和我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)流行。

3．基因型3a主要在東印度、我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)和新加坡。

4．基因型4在中東和非洲出現(xiàn)。

5．基因型5a在南非，基因型6a在我國(guó)香港被檢測(cè)到。

6．我國(guó)大陸以1b和2a為主要株型，其他基因型少見。

基因型的差別在于：①在發(fā)病過程中的侵襲力。例如，基因型1b在肝硬化中比基因型2有更高的發(fā)病率。②病毒復(fù)制程度。例如基因型3a的平均病毒濃度低于基因型1b。③對(duì)于干擾素的反應(yīng)程度。1型比2型、3型差。

HCV是一種經(jīng)腸道外途徑傳播的肝炎病毒，傳染源主要為急性臨床型和無癥狀的亞臨床病人、慢性病人和病毒攜帶者。一般病人發(fā)病前12d，其血液即有感染性，并可帶毒12年以上。HCV主要經(jīng)血源傳播，國(guó)外30%～90%輸血后肝炎為丙型肝炎，我國(guó)輸血后肝炎中丙型肝炎占1／3。此外還可通過其他方式如母嬰垂直傳播，家庭日常接觸和性傳播等。輸入含HCV或HCVRNA的血漿或血液制品，一般經(jīng)6～7周潛伏期后急性發(fā)病。臨床表現(xiàn)全身無力，胃納差，肝區(qū)不適，1／3病人有黃疸，ALT升高，抗HCV抗體陽性。臨床丙型肝炎病人50%可發(fā)展為慢性肝炎，甚至部分病人會(huì)導(dǎo)致肝硬化及肝細(xì)胞癌。其余約半數(shù)病人為自限性，可自動(dòng)康復(fù)。

我國(guó)已規(guī)定，檢測(cè)抗-HCV是過篩獻(xiàn)血員的必需步驟，對(duì)血制品亦需進(jìn)行檢測(cè)以防污染。疫苗的研制有一定難度，因HCV免疫原性不強(qiáng)，且毒株易變異。感染丙型肝炎病毒的初期，患者沒有任何不舒服的感覺。在2個(gè)月左右的潛伏期后，只有大約1／4的病人會(huì)出現(xiàn)食欲差、疲倦、黃疸等癥狀；而大部分的患者卻沒有任何感覺。而且，感染后大約要經(jīng)過20年才會(huì)出現(xiàn)肝硬化。因此，有很多人根本不知道自己已經(jīng)被感染。因此，要想知道自己有沒有感染上，最重要的辦法是查看血液中是否有病毒。病人在急性感染后的數(shù)天內(nèi)，血清中會(huì)出現(xiàn)病毒RNA，并且在產(chǎn)生抗體前一直會(huì)存在幾個(gè)月，所以通過檢查病毒抗原或病毒RNA可以幫助早期診斷。但是，目前用的試劑是利用丙型肝炎病毒基因所產(chǎn)生的病毒蛋白做成的，所以，并不能直接檢查。而且，由于血液中的丙型肝炎病毒數(shù)量相當(dāng)少，有時(shí)甚至測(cè)不出。這并不表示沒有丙型肝炎，只是代表病毒當(dāng)時(shí)的活性很低。病毒在體內(nèi)悄悄地“躲藏”7～8周之后，這時(shí)，在患者的血液中可查出丙型肝炎病毒的相關(guān)抗體。但是，這種抗體并不具有中和或者消除入侵病毒的作用，也就是說，這種抗體是沒有保護(hù)作用的，這是和乙型肝炎不同的地方。因此，丙型肝炎病毒抗體陽性，并不表示不會(huì)再得丙型肝炎，只是代表病人曾經(jīng)感染過或正在感染丙型肝炎而已。

對(duì)于血清抗HCV陽性而肝功能正常者來說，必須進(jìn)行進(jìn)一步的檢查和觀察。因?yàn)?，單純的抗HCV陽性有可能是假陽性或丙型肝炎已經(jīng)痊愈。因此，最好用PCR方法檢測(cè)病人血中的HCV RNA，如果陰性可繼續(xù)觀察肝功能，肝功能持續(xù)正常者可不必治療。若肝功能異常（如ALT持續(xù)升高，又有明顯輸血、手術(shù)等病史），特別是丙肝病毒核糖核酸（HCV RNA）陽性的患者應(yīng)該考慮抗病毒治療。

大部分HCV感染者，體內(nèi)均出現(xiàn)抗-HCV。因此，檢測(cè)抗-HCV對(duì)丙型肝炎診斷很有價(jià)值?？?HCV陽性是HCV感染的標(biāo)志。但目前檢測(cè)結(jié)果不能充分反映急性、慢性抑或恢復(fù)期感染?？贵w效價(jià)也不能反映HCV感染的強(qiáng)度，至少在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中未能證實(shí)?？笻CV陽性可能表示近期感染后的免疫狀態(tài)，但大多數(shù)表示現(xiàn)癥HCV感染，并在一定程度上反映個(gè)體的傳染性。人體感染HCV至抗HCV陽轉(zhuǎn)，這段時(shí)間個(gè)體窗口期長(zhǎng)短差異很大，目前所用方法，測(cè)出抗體較晚，尚有20%丙型肝炎患者始終不出現(xiàn)抗HCV，故實(shí)際感染率比檢出率高，抗HCV陰性不能除外HCV感染。人感染HCV后反應(yīng)可有4種表現(xiàn)：①被動(dòng)輸入高滴度抗HCV陽性血，于輸血后抗HCV即陽性，5周后轉(zhuǎn)陰。以后又出現(xiàn)抗HCV自動(dòng)抗體，可持續(xù)陽性。②遲發(fā)性抗HCV反應(yīng)并持續(xù)陽性，一般于輸血后20～22周或病后14～16周抗HCV陽轉(zhuǎn)，迅速達(dá)高峰，持續(xù)陽性10年以上。③遲發(fā)性短期抗HCV反應(yīng)，于輸血后19～21周或病后9～11周抗HCV陽轉(zhuǎn)，1年后轉(zhuǎn)陰。④無反應(yīng)，多見一過性HCV感染，抗HCV始終陰性。

目前抗HCV檢測(cè)分為兩個(gè)層次，一為過篩試驗(yàn)，常規(guī)使用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）法、化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法，床邊診斷（POCT）使用層析金標(biāo)法；二為確認(rèn)實(shí)驗(yàn)HCV-RIBA。ELISA法：第一代試劑盒已停用，因?yàn)橹话环墙Y(jié)構(gòu)區(qū)NS4；第二代試劑在感染后平均10周左右檢出，只包被核心區(qū)C22和非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3NS4；第三代試劑盒感染后平均7～9周可檢出，包被核心區(qū)C22和非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3、NS4、NS5區(qū)。而層析金標(biāo)法包被的HCV混合抗原與ELISA第三代試劑盒相同。上述的化學(xué)發(fā)光法需要免疫分析儀，放射免疫法及ELISA法用于批量檢測(cè)，不能及時(shí)出結(jié)果。而層析金標(biāo)法主要用于HCV初篩，如無償獻(xiàn)血的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等。任何測(cè)定陽性結(jié)果都須用其他方法進(jìn)一步確認(rèn)。層析金標(biāo)法具有操作簡(jiǎn)單、快捷，而且乙肝、HCV、甲肝、庚肝、戊肝、類風(fēng)濕因子（RF）、紅斑狼瘡等各種類型的標(biāo)本不會(huì)對(duì)測(cè)試產(chǎn)生干擾等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有許多廠家能提供抗HCV層析金標(biāo)法的試劑。下面以英科新創(chuàng)提供的試劑為例對(duì)抗HCV的檢測(cè)進(jìn)行詳細(xì)的闡述。

【檢測(cè)原理】　anti-HCV診斷試劑（膠體金）法采用膠體金免疫層析技術(shù)，在玻璃纖維素膜上預(yù)包被金標(biāo)鼠抗人IgG抗體（anti-IgGAb），在硝酸纖維素膜上檢測(cè)線和對(duì)照線處分別包被丙肝混合抗原（Core、NS3、NS4、NS5）和人IgG抗體。檢測(cè)陽性樣本時(shí)，血清樣本中anti-HCV與膠體金鼠抗人IgG抗體結(jié)合形成復(fù)合物，由于層析作用復(fù)合物沿紙條向前移動(dòng)，經(jīng)過檢測(cè)線時(shí)與預(yù)包被的抗原結(jié)合形成“Au-anti-IgGAb-HCVAb-HCVAg”夾心物而凝聚顯色，游離鼠抗人IgG抗體則在對(duì)照線處與人IgG抗體結(jié)合而富集顯色。陰性標(biāo)本則僅在對(duì)照線處顯色，15min內(nèi)觀察結(jié)果即可。

【適應(yīng)證】　定性測(cè)定人血清（漿）中的HCV抗體，用于無償獻(xiàn)血的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

【標(biāo)本采集】

1．采集靜脈血樣本必須在無菌條件下操作，并避免樣本溶血。

2．如果血清和血漿樣本收集后7d內(nèi)檢測(cè)，樣本須放在0～ 4℃保存；大于7d須-20℃以下冷凍保存。

3．常規(guī)抗凝劑不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4．溶血、黏稠及高脂標(biāo)本不適于本試劑。含特殊物質(zhì)的標(biāo)本可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，在檢測(cè)前須清除。

【操作方法】

1．將待測(cè)標(biāo)本從包裝盒中取出，平衡至室溫并編號(hào)。

2．將膠體金試紙條（或測(cè)試卡）從包裝盒取出，平置于臺(tái)面上。

3．用塑料滴管加1滴（10μl）樣本血清或血漿，加到試紙條指示箭頭下端的加樣孔處（測(cè)試卡加在S孔）。

4．隨即滴加2滴樣本稀釋液（約100μl）（測(cè)試卡加在D孔）。

5．加樣后，陽性標(biāo)本可在1～15min內(nèi)檢出，建議15min后再最終觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【結(jié)果判讀】

1．陽性　試紙條／測(cè)試卡在檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)位置出現(xiàn)兩條紫紅色條帶，在檢測(cè)區(qū)即使只有微弱的色帶也應(yīng)判定為陽性結(jié)果。

2．陰性　試紙條／測(cè)試卡只在對(duì)照區(qū)位置出現(xiàn)一條紫紅色條帶。

3．失效　對(duì)照區(qū)（C）未出現(xiàn)紫紅色條帶，表明不正確的操作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。在此情況下，應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書，并用新的試紙條／測(cè)試卡重新測(cè)試。

【參考范圍】　陰性。

【臨床意義】

1．主要表示HCV感染，但是否有現(xiàn)癥感染還要結(jié)合其他標(biāo)志物檢測(cè)。

2．HCV-RNA是病毒在體內(nèi)存在的確切標(biāo)志，因此它可以指示現(xiàn)癥感染及治療檢測(cè)。

【局限性】

1．本法為初篩試驗(yàn)，測(cè)定陽性結(jié)果都須用其他方法進(jìn)一步確認(rèn)。

2．本法為定性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)靈敏度低5～10ng／ml。

【方法學(xué)優(yōu)點(diǎn)】

1．操作簡(jiǎn)單、快捷，15min可出結(jié)果。

2．乙肝、HCV、甲肝、庚肝、戊肝、類風(fēng)濕因子（RF）、紅斑狼瘡等各種類型的標(biāo)本不會(huì)對(duì)測(cè)試產(chǎn)生干擾。