實(shí)驗(yàn)三十三　增強(qiáng)免疫力功能試驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求

1．熟悉動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作技術(shù)與要求；

2．掌握增強(qiáng)免疫力功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)的方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1．免疫力是人體免疫系統(tǒng)進(jìn)行自我保護(hù)的一種能力，主要的作用之一是身體抵抗細(xì)菌或病毒等感染的能力。健全的免疫系統(tǒng)主要有三大功能：

（1）防御功能———保護(hù)機(jī)體不受損害，幫助機(jī)體消滅外來(lái)的細(xì)菌、病毒以及避免發(fā)生疾病；

（2）穩(wěn)定清潔功能———不斷清除衰老死亡的細(xì)胞，保持體內(nèi)的凈化更新；

（3）監(jiān)控功能———及時(shí)識(shí)別和清除染色體畸變或基因突變的細(xì)胞，防止腫瘤和癌變的發(fā)生。

2．機(jī)體的免疫力功能包括細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核－巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性4個(gè)方面，通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后免疫系統(tǒng)的變化來(lái)判斷樣品是否具有增強(qiáng)免疫力的功能。

三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1．儀器

（1）200目篩網(wǎng)；

（2）24孔培養(yǎng)板；

（3）96孔培養(yǎng)板（平底）；

（4）玻片架；

（5）微量血凝實(shí)驗(yàn)板；

（6）血色素吸管；

（7）手術(shù)器械；

（8）打孔器；

（9）計(jì)時(shí)器；

（10）二氧化碳培養(yǎng)箱；

（11）超凈工作臺(tái)；

（12）恒溫水??；

（13）離心機(jī)；

（14）酶標(biāo)儀；

（15）721型分光光度計(jì)；

（16）顯微鏡。

2．試劑

（1）生理鹽水；

（2）丙酮；

（3）甲醇；

（4）鹽酸；

（5）異丙醇；

（6）二硝基氟苯（DNFB）；

（7）麻油；

（8）硫化鋇；

（9）Na₂CO₃；

（10）RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液；

（11）小牛血清；

（12）2－巰基乙醇（2－ME）；

（13）青霉素；

（14）鏈霉素；

（15）刀豆蛋白A（ConA）；

（16）Hanks液；

（17）PBS緩沖液（pH　7．2～7．4）；

（18）SA緩沖液；

（19）瓊脂糖；

（20）印度墨汁；

（21）綿羊紅細(xì)胞（SRBC）；

（22）雞紅細(xì)胞；

（23）YAC－1細(xì)胞；

（24）補(bǔ)體（豚鼠血清）；

（25）MTT（一種淡黃色的唑氮鹽）；

（26）Giemsa染液；

（27）乳酸鋰或乳酸鈉；

（28）硝基氯化四氮唑（INT）；

（29）吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）；

（30）氧化型輔酶Ⅰ（NAD）；

（31）0．2mol／L的Tris－HCl緩沖液（pH　8．2）；

（32）1%NP40或2．5%Triton。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1．樣品處理與給予方式

（1）對(duì)于水溶性樣品，用蒸餾水配制成溶液或懸浮液灌胃給予動(dòng)物；對(duì)于脂溶性樣品，用調(diào)和油配制成溶液或懸浮液灌胃給予動(dòng)物。

（2）受試樣品推薦量較大，超過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的灌胃量、加入飲水或摻入飼料的承受量等情況時(shí)，可適當(dāng)減少受試樣品中的非功效成分的含量。

（3）對(duì)于含乙醇的受試樣品，原則上應(yīng)使用其定型的產(chǎn)品進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，其三個(gè)劑量組的乙醇含量與定型產(chǎn)品相同。如受試樣品的推薦量較大，超過(guò)動(dòng)物最大灌胃量時(shí)，允許將其進(jìn)行濃縮，但最終的濃縮液體應(yīng)恢復(fù)原乙醇含量。如乙醇含量超過(guò)15%，允許將其含量降至15%。調(diào)整受試樣品乙醇含量應(yīng)使用原產(chǎn)品的酒基。

（4）液體受試樣品需要濃縮時(shí)，應(yīng)盡可能選擇不破壞其功效成分的方法。一般可選擇60～70℃減壓進(jìn)行濃縮。濃縮的倍數(shù)依具體實(shí)驗(yàn)要求而定。

（5）對(duì)于以沖泡形式飲用的受試樣品（如袋泡劑），可使用該受試樣品的水提取物進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，提取的方式應(yīng)與產(chǎn)品推薦飲用的方式相同。如產(chǎn)品無(wú)特殊推薦飲用方式，則采用下述提取的條件：常壓，溫度80～90℃，時(shí)間30～60min，水量為受試樣品體積的10倍以上，提取2次，將其合并濃縮至所需濃度。

（6）必須經(jīng)口給予受試樣品，首選灌胃。如無(wú)法灌胃則加入飲水或摻入飼料中，計(jì)算受試樣品的給予量。

（7）以載體和功效成分（或原料）組成的受試樣品，當(dāng)載體本身可能具有相同功能時(shí)，應(yīng)將該載體作為對(duì)照。

2．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

（1）動(dòng)物選擇：推薦用近交系小鼠，20g±2g，單一性別，每組10～15只。

（2）劑量分組：實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)空白對(duì)照組，以人體推薦量的10倍為其中一個(gè)劑量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組，必要時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。

（3）樣品給予時(shí)間：所有試驗(yàn)動(dòng)物均食用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)配合飼料，動(dòng)物自由攝食、攝水。給予受試物的灌胃體積為20ml／（kg·BW）。受試樣品給予時(shí)間30天，必要時(shí)可延長(zhǎng)至45天，免疫模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可適當(dāng)延長(zhǎng)。

3．指標(biāo)檢測(cè)

（1）ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT法）

①試劑配制

a．完全培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)液過(guò)濾除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺（200mmol／L），青霉素（100U／ml），鏈霉素（100μg／L）及5×10^－5　mol／L的2－巰基乙醇，用無(wú)菌的1mol／L的HCl或1mol／L的NaOH調(diào)pH至7．0～7．2，即完全培養(yǎng)液。

b．ConA液：用雙蒸水配制成100μg／ml的溶液，過(guò)濾除菌，在低溫冰箱（－20℃）中保存。

c．無(wú)菌Hanks液：用前以3．5%的無(wú)菌NaHCO₃調(diào)pH至7．2～7．4。

d．MTT液：將5mg MTT溶于1ml pH　7．2的PBS中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

e．酸性異丙醇溶液：96ml異丙醇中加入4ml　1mol／L的HCl，臨用前配制。

②脾細(xì)胞懸液制備：無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)菌Hanks液平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，或用4層紗布將脾磨碎，用Hanks液洗2次，每次離心10min（1000r／min）。然后將細(xì)胞懸浮于1ml完全培養(yǎng)液中，用溴酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10⁶個(gè)／ml。

③淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)：將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液（相當(dāng)于7．5μg／ml），另一孔作為對(duì)照，置5%CO₂，37℃CO₂孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0．7ml，加入0．7ml不含小牛血清的RPMI　1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT（5mg／ml）50μl／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔分裝3～6孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，以570nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值。也可將溶解液直接移入2ml比色杯中，721型分光光度計(jì)上在波長(zhǎng)570nm測(cè)定OD值。

（2）二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（耳腫脹法）

①DNFB溶液的配制：DNFB溶液應(yīng)新鮮配制，稱取DNFB　50mg，置清潔干燥小瓶中，將預(yù)先配好的5ml丙酮麻油溶液（丙酮∶麻油＝1∶1）倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封?；靹蚝?，用250μl注射器通過(guò)瓶蓋取用。

②致敏：每鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3cm×3cm、用DNFB溶液50μl均勻涂抹致敏。

③DTH的產(chǎn)生與測(cè)定：5天后，用DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊。攻擊后24h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重。

（3）抗體生成細(xì)胞檢測(cè)（Jerne改良玻片法）

①SRBC：綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個(gè)方向搖動(dòng)，以脫纖維，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。

②制備補(bǔ)體：采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清），將1ml壓積SRBC加入5ml豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，經(jīng)常振蕩，離心取上清，分裝，－70℃保存。用時(shí)以SA液按1∶（8～15）稀釋。

③玻片涂膜：在清潔玻片上刷上一薄層瓊脂糖（0．5g瓊脂糖加雙蒸水至100ml，加熱溶解），待干后放片盒可長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/p>

④免疫動(dòng)物：取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2　000r／min）10min，計(jì)數(shù)細(xì)胞，每只鼠經(jīng)腹腔或靜脈注射SRBC　5×10⁷～2×10⁸個(gè)。也可將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（V／V）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0．2ml。

⑤脾細(xì)胞懸液制備：將SRBC免疫4～5天后的小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，放在盛有Hanks液的小平皿內(nèi)，輕輕撕碎脾臟，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，或用4層紗布將脾磨碎，離心（1　000r／min）10min，用Hanks液洗2遍，最后將細(xì)胞懸浮在5ml RPMI　1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×10⁶個(gè)／ml。也可將細(xì)胞懸浮在8ml Hanks液，測(cè)定脾空斑形成數(shù)。

⑥空斑的測(cè)定：將表層培養(yǎng)基（1g瓊脂糖加雙蒸水至100ml）加熱溶解后，放45℃水浴保溫，與等量pH　7．2～7．4、2倍濃度的Hanks液混合，分裝小試管，每管0．5ml，再向管內(nèi)加50μl　10%SRBC（V／V，用SA液配制），20μl脾細(xì)胞懸液（5×10⁶個(gè)／ml）或25μl脾細(xì)胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育1～1．5h，然后用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體（1∶8）加到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1～1．5h后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。

（4）血清溶血素的測(cè)定（血凝法）

①SRBC：綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個(gè)方向搖動(dòng)，以脫纖維，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。

②免疫動(dòng)物及血清分離：取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2　000r／min）10min。將壓積SRBC用生理鹽水配成2%（V／V）的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0．2ml進(jìn)行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2　000r／min離心10min，收集血清。

③凝集反應(yīng)：用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi)，每孔100μl，再加入100μl　0．5%（V／V）的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤(rùn)的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3h，觀察血球凝集程度。

血清凝集程度一般分為5級(jí)（0～Ⅳ）記錄，按下式計(jì)算抗體積數(shù)，受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于對(duì)照組的抗體水平，可判定該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

抗體水平＝（S₁＋2S₂＋3S₃＋…＋nS_n）

式中1、2、3…n代表對(duì)倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級(jí)別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。

0級(jí)：紅細(xì)胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀，四周液體清晰。

Ⅰ級(jí)：紅細(xì)胞大部分沉積在孔底成圓點(diǎn)狀，四周有少量凝集的紅細(xì)胞。

Ⅱ級(jí)：凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個(gè)疏松的紅點(diǎn)。

Ⅲ級(jí)：凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個(gè)小紅點(diǎn)。

Ⅳ級(jí)：凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時(shí)成卷折狀。

（5）小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

①溶液配制

a．注射用墨汁：將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋3～4倍。

b．Na₂CO₃溶液：取0．1g Na₂CO₃，加蒸餾水至100ml。

②注射墨汁：稱體重，從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁，按每10g體重0．1ml計(jì)算。待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。

③測(cè)定：注入墨汁后2、10min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，并立即將其加到2ml 0．1%Na₂CO₃溶液中。用721型分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值（OD），以Na₂CO₃溶液作空白對(duì)照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。按下列公式計(jì)算吞噬指數(shù)：

（6）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（半體內(nèi)法）

①雞紅細(xì)胞懸液制備：取雞血置于有玻璃珠的錐形瓶中，朝一個(gè)方向充分搖動(dòng)，以脫纖維。用生理鹽水洗滌2～3次，離心（2　000r／min，10min），去上清，用生理鹽水配成20%（V／V）的雞紅細(xì)胞懸液。

②吞噬功能測(cè)定：每鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液1ml。間隔30min，頸椎脫臼處死動(dòng)物，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2ml，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃孵箱溫育30min。孵畢，于生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細(xì)胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4%（V／V）Giemsa－磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗晾干，每張片由鏡下觀察100個(gè)巨噬細(xì)胞，按下式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)：

在計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)同時(shí)觀察雞紅細(xì)胞被消化的程度。借以判定巨噬細(xì)胞吞噬與消化功能，通常分為4級(jí)：

Ⅰ級(jí)：未消化。被吞噬的雞紅細(xì)胞完整，胞質(zhì)淺紅或淺黃帶綠色，胞核淺紫色。

Ⅱ級(jí)：輕度消化。胞質(zhì)淺黃綠色、胞核固縮呈紫藍(lán)色。

Ⅲ級(jí)：重度消化。胞質(zhì)淡染，胞核淡淺灰色。

Ⅳ級(jí)：完全消化。巨噬細(xì)胞內(nèi)僅見形態(tài)類似雞紅細(xì)胞大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。

（7）NK細(xì)胞活性測(cè)定（乳酸脫氫酶測(cè)定法）

①乳酸脫氫酶LDH基質(zhì)液的配制

乳酸鋰5×10^－2　mol／L

硝基氯化四氮唑（INT）6．6×10^－4　mol／L

吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）2．8×10^－4　mol／L

氧化型輔酶Ⅰ（NAD）1．3×10^－3　mol／L

將上述試劑溶于0．2mol／L的Tris－HCl緩沖液中（pH　8．2）

②靶細(xì)胞的傳代（YAC－1細(xì)胞）：實(shí)驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×10⁵個(gè)／ml。

③脾細(xì)胞懸液的制備（效應(yīng)細(xì)胞）：無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)菌Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，或用4層紗布將脾磨碎，或用Hanks液洗2次，每次離心10min（1　000r／min）。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0．5ml滅菌水20s，裂解紅細(xì)胞后再加入0．5ml　2倍Hank’s液及8ml Hank’s液，1　000r／min，10min離心，用1ml含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù)（活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95%以上），用溴酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95%以上），最后用RPMI　1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁷個(gè)／ml。

④NK細(xì)胞活性檢測(cè)：取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100μl（效靶比50∶1），加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μl，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%NP40或2．5%Triton各100μl；上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1　500r／min離心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100μl，反應(yīng)3min，每孔加入1mol／L的HCl　30μl，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定光密度值（OD）。

按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性：

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

增強(qiáng)免疫力功能判定　在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核－巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性四個(gè)方面任兩個(gè)方面結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品增強(qiáng)免疫力功能。

1．細(xì)胞免疫功能結(jié)果判定　細(xì)胞免疫功能測(cè)定項(xiàng)目中的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽(yáng)性，可判定細(xì)胞免疫功能測(cè)定結(jié)果陽(yáng)性。

2．體液免疫功能結(jié)果判定　體液免疫功能測(cè)定項(xiàng)目中的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽(yáng)性，可判定體液免疫功能測(cè)定結(jié)果陽(yáng)性。

3．單核－巨噬細(xì)胞功能結(jié)果判定　單核－巨噬細(xì)胞功能測(cè)定項(xiàng)目中的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，或任一個(gè)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽(yáng)性，可判定單核－巨噬細(xì)胞功能結(jié)果陽(yáng)性。

4．NK細(xì)胞活性結(jié)果判定　NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)劑量組結(jié)果陽(yáng)性，可判定NK細(xì)胞活性結(jié)果陽(yáng)性。

六、注意事項(xiàng)

1．MTT法測(cè)定ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇有絲分裂原時(shí)ConA的濃度很重要，ConA的濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生抑制作用，不同批號(hào)的ConA在實(shí)驗(yàn)前要預(yù)試，以找到最佳刺激分裂濃度。

2．二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)操作時(shí)，應(yīng)避免DNFB與皮膚接觸。

3．血清溶血素的測(cè)定時(shí)，血清稀釋要充分混勻，最后一個(gè)稀釋度應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。

4．小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)，靜脈注入碳粒的量、取血時(shí)間、取血量一定要準(zhǔn)確；墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，臨用前應(yīng)搖勻；使用新的墨汁時(shí)，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前摸索出一個(gè)最適墨汁注入量，即正常小鼠在20～30min內(nèi)不易廓清，而激活的小鼠可明顯廓清。

5．NK細(xì)胞活性測(cè)定時(shí)，靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞必須新鮮，細(xì)胞存活率應(yīng)大于95%；比色時(shí)環(huán)境溫度應(yīng)保持恒定；LDH基質(zhì)液應(yīng)臨用前配制；在一定范圍內(nèi)，NK細(xì)胞活性與效靶比值成正比，一般效靶比值不應(yīng)超過(guò)100∶1。