二、比色分析法及分光光度計的使用

分光光度法是根據(jù)物質(zhì)對光選擇性吸收而進行分析的方法。分光光度法具有較高的靈敏度和一定的準確度，特別適宜于微量成分的測定，并具有操作簡便、快速、適用范圍廣等特點，在生物化學(xué)中占有重要的地位。

吸光光度法使用的儀器，主要由如圖1-4所示的五部分組成。目前，常用的581G光電比色計，72型、721型、722型及751G型等分光光度計，都是在上述五個部件的基礎(chǔ)上，增加了靈敏度、準確度、穩(wěn)定性和各種自動化裝置的、具有不同性能的分光光度計。

下面主要介紹751G分光光度計的構(gòu)造和使用方法。

圖1-4　吸光光度法的基本組成部件

（一）構(gòu)造

751G型分光光度計是可見光和紫外光分光光度計，其波長范圍為200～1000nm，在波長為300～1000nm范圍內(nèi)用鎢燈作光源，在波長為200～320nm范圍內(nèi)用氫燈作光源。因此可廣泛用于測定紫外光區(qū)、可見光及近紅外區(qū)有吸收光譜的物質(zhì)，進行定性及定量分析。

751G型分光光度計為20世紀70年代產(chǎn)品。80年代以來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各種新型產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，新型儀器操作方便，有自動顯示測定數(shù)字及打印裝置等如53WB紫外可見光分光光度計?？紤]到目前更普遍使用的還是751G型，因此本教材仍著重介紹它的使用方法。儀器結(jié)構(gòu)圖如圖1-5所示。

圖1-5　751G型分光光度計結(jié)構(gòu)示意圖（正視）

（二）使用方法

1．將751G型分光光度計與穩(wěn)壓電源相連，插上電源插頭。

2．儀器主機有2個光源，根據(jù)使用波長可選用氫燈或鎢燈，撥動主機背面的光源選擇桿到所需的光源方向，使光源燈置于光路中。

3．在打開儀器的各種開關(guān)前，仔細檢查各種開關(guān)及旋鈕是否均處于關(guān)閉位置，打開穩(wěn)壓電源，當電壓達到220V時，再打開放大器電源和所需的燈源開關(guān)，儀器預(yù)熱20min，當氫燈穩(wěn)壓電源工作電流達到300mA時儀器即可正常工作。

4．選用比色杯，350nm以上用玻璃比色杯，350nm以下用石英比色杯。將待測溶液（1個空白液，3個被測液）盛入比色杯中約為杯體積的3/4，不要太滿，以免拉動試樣選擇手柄時比色杯中液體溢出，損壞儀器。用擦鏡紙將沾在比色杯外的液體擦凈。將比色杯垂直放入比色架上，打開樣品室蓋5，使比色架對準暗箱的釘梢放穩(wěn)后，蓋上樣品室蓋。移動試樣選擇手柄7，使裝空白液體的比色杯移入光路中。注意，移動滑板應(yīng)處于定位槽中。

5．轉(zhuǎn)動波長選擇旋鈕10至波長分度盤對準所需波長。

6．根據(jù)測定波長選擇光電管。波長為200～625nm時選用藍敏光電管，將光電管選擇手柄8推入。波長為625～1000nm時選用紅敏光電管，則將光電管選擇手柄8拉出。

7．將選擇開關(guān)12由關(guān)閉位置撥至校正位置后調(diào)節(jié)暗電流旋鈕14，使電表2指針對準“0”位置。為了使測定正確，每測量一次均應(yīng)用暗電流旋鈕校正電表2，使指針在“0”的位置。

8．調(diào)節(jié)靈敏度旋鈕13，在正常情況下，從關(guān)閉位置起沿順時針方向轉(zhuǎn)動3～5圈。

9．轉(zhuǎn)動讀數(shù)電位器旋鈕11，使測量讀數(shù)盤光吸收準確處于“0”的位置（透光率為100％）。

10．將選擇開關(guān)撥到“×1”的位置，拉開光門旋鈕6，使單色光進入光電管（此時絕對不要打開樣品槽蓋5以保護光電管），這時電表指針偏移“0”位，用狹縫調(diào)節(jié)旋鈕4，使電表指針大致到達“0”位附近，再用靈敏度旋鈕13仔細調(diào)節(jié)，使電表指針正確地指在“0”位置上。

11．完成上述操作后，立即拉開試樣選擇手柄7。使第二個待測樣品的比色杯處于光路中。注意，滑板應(yīng)準確位于定位槽中，此時電表指針偏離“0”位，旋轉(zhuǎn)讀數(shù)電位器旋鈕11，使電表指針重新對準“0”位，立即從測量讀數(shù)盤1上讀出光吸收值（A）。再拉出試樣選擇手柄7，讀取第二、第三個樣品溶液的光吸收值。

12．完成上述測量后，立即關(guān)上（推入）光門旋鈕6，以保護光電管，只有處于這種狀態(tài)才能打開樣品槽蓋，更換待測溶液，使空白樣品處于光路中，重復(fù)第7～12步驟，繼續(xù)測定。

13．當被測定溶液光吸收值大于1.0，透光率小于10％時，把選擇開關(guān)12撥到“×0.1”的位置上，轉(zhuǎn)動讀數(shù)電位器旋鈕，重新讀數(shù)，讀得光吸收值應(yīng)加上1.0，透光率則除以10。

14．測定完畢，將每個開關(guān)、旋鈕、手柄等恢復(fù)原狀（均處于關(guān)閉狀態(tài)），拔掉電源插頭以切斷電源，蓋好儀器罩。

（三）注意事項

1．若外電路電壓波動較大，應(yīng)外接一臺電壓穩(wěn)壓器，以增加儀器的穩(wěn)定性。

2．比色杯誤差的校正：在4個比色杯中注入蒸餾水，在相同波長下測定4個比色杯的光吸收值。若相互間差異較大，則應(yīng)在讀數(shù)后加上或減去相應(yīng)差值。

3．比色杯的清洗，用0.1mol/L HCl和乙醇溶液浸泡去污，用蒸餾水充分清洗干凈、晾干備用。