二、Folin-酚試劑法（Lowry法）

（一）實驗?zāi)康?/p>

1．了解Folin-酚試劑法定量測定蛋白質(zhì)的基本原理。

2．掌握Folin-酚試劑法定量測定蛋白質(zhì)的實驗方法。

（二）實驗原理

Folin-酚試劑法又名Lowry法，是雙縮脲法的發(fā)展。Folin-酚試劑由甲、乙兩部分試劑組成。甲試劑使蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，生成紫紅色絡(luò)合物，相當(dāng)于雙縮脲反應(yīng)。乙試劑在堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基還原呈藍色（鉬藍、鎢藍混合物），其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，因此通過比色可測定蛋白質(zhì)的濃度。

此方法比雙縮脲法靈敏100倍，較紫外分光光度法靈敏10～20倍。

（三）實驗藥品、實驗設(shè)備

1．血清：人血清，使用前稀釋100倍。

2．0.5g/L酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：稱取酪蛋白125.0mg，用0.1mol/L氫氧化鈉溶解后，加蒸餾水定容至250mL。

3．Folin-酚試劑：

甲試劑：（1）稱取無水碳酸鈉（Na₂CO₃）2g，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液100mL，混勻。（2）稱取五水合硫酸銅（CuSO₄·5H₂O）0.5g，加入1％酒石酸鉀鈉溶液100mL，混勻。使用前，將（1）與（2）按50∶1混合即成堿性硫酸銅溶液。混合后，試劑只能使用1天。

乙試劑：在2L磨口回流裝置內(nèi)加二水合鎢酸鈉（Na₂WO₄·2H₂O）100g，二水合鉬酸鈉（Na₂MoO₄·2H₂O）25g，蒸餾水700mL，14.68mol/L（85％），磷酸50mL，濃鹽酸100mL充分混合后用小火回流10h。冷卻后，再加硫酸鋰（Li₂SO₄）150g，蒸餾水50mL，液溴數(shù)滴，然后開口沸騰15min，以驅(qū)除過量溴。注意：溴氣有毒，要在通風(fēng)櫥中進行。冷卻后用蒸餾水定容至1000mL，過濾，濾液為淡黃色，置于棕色瓶中，可在冰箱內(nèi)長期保存。若濾液變綠，可加液溴幾滴，煮沸數(shù)分鐘至溶液恢復(fù)淡黃色即可。乙試劑使用前，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚酞為指示劑，標(biāo)定乙試劑酸度，使用時適當(dāng)稀釋（約1倍），使最終酸濃度為1mol/L，這樣就制成為乙試劑工作溶液。置于冰箱中長期保存。

4．分光光度計。

5．電熱恒溫水浴箱。

6．15mm×150mm試管9支。

7．0.5mL、1mL、5mL刻度吸管。

8．試管架。

9．容量瓶。

（四）實驗方法

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取7支試管編號，按表2-11所示順序和劑量加入各試劑，迅速混勻，在20～25℃（或室溫下）放置30min，用分光光度計在波長500nm下，以“0”管試液作參比，測定各管吸光度。

以各吸光度為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制吸光度-蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2-11　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2．血清測定

取兩支試管編號，按表2-12所示順序和劑量加入試劑。

表2-12　血清中蛋白質(zhì)濃度的測定

迅速混勻，于20～25℃（或室溫）下放置30min，用分光光度計在波長500nm下，以空白管試液作參比，測定測定管吸光度。

3．結(jié)果處理

根據(jù)測定管吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為血清中蛋白質(zhì)濃度。

4．注意事項

（1）Folin-酚乙試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，在加入到堿性的銅離子-蛋白質(zhì)溶液中時（pH值約為10），必須立即混勻，以便在磷鉬酸、磷鎢酸試劑破壞之前，即發(fā)生還原反應(yīng)。

（2）本法受多種因素干擾，凡對雙縮脲反應(yīng)起干擾作用的基團以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液均可干擾Folin-酚反應(yīng)。

（3）所測蛋白質(zhì)樣品中，若含酚類及檸檬酸也干擾Folin-酚反應(yīng)。在測試時應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗。

（五）實驗記錄

1．吸光度-蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

2．實驗記錄：

（六）思考題

1．根據(jù)Folin-酚測定蛋白質(zhì)的原理，哪些因素可干擾蛋白質(zhì)含量的測定？

2．作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白應(yīng)有何要求？