實(shí)驗(yàn)十四　TCA法和丙酮法沉淀濃縮蛋白質(zhì)

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1．了解TCA法和丙酮法沉淀濃縮蛋白質(zhì)的原理。

2．了解TCA法和丙酮法沉淀蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點(diǎn)。

【實(shí)驗(yàn)原理】

蛋白質(zhì)能被某些有機(jī)溶劑沉淀下來，一方面是由于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑加入水中使溶劑介電常數(shù)降低，增加了相反電荷的吸引力，另一方面是因?yàn)檫@些有機(jī)溶劑是強(qiáng)親水試劑，爭奪蛋白質(zhì)分子表面的水化水，破壞蛋白質(zhì)膠體分子表面的水化層而使分子聚集沉淀。在等電點(diǎn)時(shí)沉淀效果更好。

常溫下有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)變性，低溫條件下可減慢變性速度。因此用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行。如利用丙酮沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，必須在0～4℃低溫下進(jìn)行。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離，否則蛋白質(zhì)會(huì)變性。

三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白質(zhì)主要基于以下幾個(gè)方面的作用:①在酸性條件下TCA能與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽;②TCA作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團(tuán)，使之聚集沉淀。

【實(shí)驗(yàn)器材】

1．5 ml離心管、5 ml離心管、移液槍、冷凍高速離心機(jī)、冷凍干燥離心機(jī)等。

【藥品試劑】

1．蛋白質(zhì)溶液。

2．20%TCA。

3．丙酮。

4．PBS磷酸緩沖液。

【實(shí)驗(yàn)方法】

1．TCA沉淀法:

(1)取500μl蛋白溶液，加入等體積預(yù)冷的20%TCA溶液，立刻混勻。

(2)冰上放置30分鐘。

(3)4℃，13200 r/min離心15分鐘。

(4)小心去除上清液，冷凍干燥沉淀，約1小時(shí)。

(5)加入50μl PBS溶解沉淀，280 nm測定蛋白質(zhì)濃度。2．丙酮沉淀法:

(1)在－20℃預(yù)冷丙酮溶液。

(2)500μl蛋白液放置于5 ml管中，加入3 ml預(yù)冷丙酮，迅速混勻，－20℃放置2小時(shí)以上或過夜。

(3)4℃，13200 r/min離心15分鐘。

(4)小心棄去上清液，注意勿接觸沉淀。加入100 ml冷的90%丙酮洗滌沉淀，4℃，13200 r/min離心5分鐘。

(5)重復(fù)上一步再次洗滌沉淀。

(6)棄去上清液，空氣中干燥沉淀15～30分鐘。

(7)加入適量PBS溶解蛋白質(zhì)沉淀。

【注意事項(xiàng)】

1．TCA沉淀法不適于大分子量蛋白質(zhì)。因?yàn)殡S著蛋白質(zhì)分子量的增大，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性與致密性也增大，TCA可能滲入分子內(nèi)部而使之較難被完全除去，在電泳前樣品加熱處理時(shí)可能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生酸水解而形成碎片，而且隨時(shí)間的延長這一作用愈加明顯。

2．含有TCA的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳時(shí)，會(huì)因?yàn)門CA的結(jié)合使SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合量產(chǎn)生偏差，從而造成蛋白質(zhì)所帶電荷的不均一性，造成遷移率的不一致，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)展寬現(xiàn)象。

3．用TCA法對小分子量蛋白質(zhì)進(jìn)行濃縮，樣品處理后要盡快進(jìn)行電泳分析，以免發(fā)生聚集及斷裂，造成結(jié)果分析的不準(zhǔn)確。

4．如果待濃縮的蛋白質(zhì)含量過少，如小于幾微克，可按每個(gè)樣品10μg的量加入胰島素作為輔助蛋白質(zhì)幫助蛋白質(zhì)沉淀濃縮。

5．丙酮沉淀法適合從大多數(shù)水相溶劑中或者混有SDS的緩沖液中抽提蛋白質(zhì)，不適于抽提在尿素或胍類變性溶液中的蛋白質(zhì)。

6．注意丙酮沉淀法需在丙酮不能溶解的容器中進(jìn)行，如polypropylene。

7．TCA法和丙酮法可以結(jié)合使用，即先用TCA沉淀，然后用冷丙酮洗滌沉淀，抽提TCA。

【思考題】

試比較分析TCA法和丙酮法沉淀濃縮蛋白質(zhì)的優(yōu)缺點(diǎn)。