對(duì)于蛋白質(zhì)定位，主要有兩大問(wèn)題需要回答：一是尋找存在于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞定位信號(hào)；二是揭示蛋白質(zhì)分子進(jìn)行精確定位的分子機(jī)制。細(xì)胞定位信號(hào)可以以不同形式存在于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，如氨基酸組成、氨基酸序列、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的修飾信號(hào)等。其中研究較多的是存在于氨基酸序列中的定位信號(hào)，使蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑的信號(hào)位于N-末端；使蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體和葉綠體的信號(hào)也位于N-末端；使蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的信號(hào)位于肽鏈的中間，使蛋白質(zhì)進(jìn)入過(guò)氧化酶體的信號(hào)位于肽鏈的C-末端。

（一）線粒體蛋白質(zhì)的定位

用同位素進(jìn)行的脈沖標(biāo)記-跟蹤試驗(yàn)證明，位于線粒體不同部位的幾百種蛋白質(zhì)分子（除少數(shù)幾種在線粒體基質(zhì)中的核糖體上合成外）絕大多數(shù)都是在細(xì)胞液中核糖體上合成并釋放后再轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中的。且這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞液中都是以一種前體的形式合成的。這些前體蛋白的N-末端一般都帶有一段并不完全相同但含有共同模體的所謂的“基質(zhì)導(dǎo)入序列”，其共同特征：富含帶正電荷的氨基酸（主要是精氨酸和賴氨酸），經(jīng)常含有絲氨酸和蘇氨酸，不含酸性氨基酸（如天門(mén)冬氨酸和谷氨酸）。進(jìn)入線粒體基質(zhì)和插入線粒體內(nèi)膜的蛋白質(zhì)（如檸檬酸合酶和細(xì)胞色素C氧化酶等）只含有上述信號(hào)肽。而進(jìn)入膜間質(zhì)的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞色素C）前體除了含有上述信號(hào)肽以外還含有一段緊接在后面的所謂的“膜間質(zhì)導(dǎo)入序列”，同樣，在將插入到外膜的前體蛋白（如外膜孔道蛋白）的上述共同信號(hào)肽之后緊接有一段所謂的“停止轉(zhuǎn)運(yùn)和外膜定位序列”。當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)束后，對(duì)進(jìn)入線粒體基質(zhì)、內(nèi)膜、膜間質(zhì)中的蛋白質(zhì)前提而言，上述共同信號(hào)將都會(huì)被特異的細(xì)胞基質(zhì)蛋白酶切除，但進(jìn)入外膜的信號(hào)序列將不被切除而留在蛋白質(zhì)分子中。

據(jù)已有的觀察結(jié)果，一個(gè)蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體基質(zhì)的一般性模型大約包括以下步驟：①前體蛋白在細(xì)胞液中的自由核糖體上被合成，并釋放到細(xì)胞液中；②細(xì)胞液中的分子伴侶蛋白，線粒體輸入刺激蛋白（mitochondrial import stimulating factor，MSF）或Hsp70，與還未完全折疊好的前體蛋白質(zhì)分子結(jié)合，以維持這種非天然構(gòu)象，并阻止它們之間的聚集；③前體蛋白上的信號(hào)序列與線粒體外膜上的特異受體／外膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體識(shí)別，并被轉(zhuǎn)運(yùn)跨過(guò)外膜；④前體蛋白在膜間質(zhì)中與位于內(nèi)膜上的“內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶復(fù)合體”接觸并被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體基質(zhì)；⑤前體蛋白上的基質(zhì)導(dǎo)入序列被線粒體基質(zhì)中的特異蛋白水解酶切除，然后蛋白質(zhì)分子自發(fā)地或在分子伴侶蛋白幫助下折疊形成其天然結(jié)構(gòu)。

上述模型主要是基于對(duì)酵母和脈孢菌這兩種模式生物的研究提出的，但有跡象表明，這種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是高度保守的。在人體細(xì)胞中蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體的機(jī)制與上面所描述的基本一樣。這種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的缺陷會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病發(fā)生，如Mohr-Tranebjaerg綜合征就是因?yàn)閷⒌鞍邹D(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體通路上的一個(gè)蛋白分子出現(xiàn)功能缺陷而引起的。

（二）細(xì)胞核蛋白質(zhì)的定位

蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，細(xì)胞核膜不同于其他細(xì)胞器膜：一方面它由脂質(zhì)雙層組成，外層膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連，內(nèi)層膜則通過(guò)核片層蛋白形成染色體的附著位點(diǎn)；另一方面核膜是不連續(xù)的，上面有一系列核孔，溝通細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。核膜對(duì)一些分子是自由開(kāi)放的，分子質(zhì)量小于40ku、直徑不大于23的分子可以以擴(kuò)散的方式通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核，但是分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)則不能自由進(jìn)出，除組蛋白有專(zhuān)門(mén)的受體介導(dǎo)外，其他大的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核均需要有特定的入核信號(hào)-核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS），而且都是通過(guò)體積巨大的細(xì)胞核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核的。

蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中合成后被運(yùn)送到細(xì)胞核中的分子過(guò)程是近年研究的一個(gè)熱點(diǎn)。在細(xì)胞質(zhì)中，核蛋白被合成、并折疊成特定的三維空間結(jié)構(gòu)，核定位信號(hào)暴露在表面，在輸入蛋白（improtin）的幫助下進(jìn)入細(xì)胞核。輸入蛋白含有αβ兩個(gè)亞基，α亞基的NLS與入核蛋白的NLS結(jié)合，β亞基與核孔蛋白質(zhì)結(jié)合，被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核。蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核是一個(gè)消耗能量的過(guò)程，由ras相關(guān)的核蛋白質(zhì)Ran調(diào)控。Ran是一個(gè)小的GTP酶，可以與GDP或GTP結(jié)合，Ran-GDP幫助輸入蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核；Ran-GTP介導(dǎo)空載的輸入蛋白β亞基出核，圖7-8為蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核和輸出細(xì)胞核的過(guò)程。Ran-GTP在Ran GTP激活蛋白的作用下GTP被水解成GDP；細(xì)胞質(zhì)中形成的Ran-GDP與β亞基脫離后，可能通過(guò)某種機(jī)制再被運(yùn)回到細(xì)胞核中，然后在一種叫做Ran核苷酸交換因子的作用下被轉(zhuǎn)變成Ran-GTP形式，α亞基能自由地通過(guò)核孔。這樣，α、β亞基和Ran-GTP／Ran-GDP都可以在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中進(jìn)入另一輪的核蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)。

（三）分泌蛋白的定位

利用同位素示蹤技術(shù)以及蛋白水解酶實(shí)驗(yàn)表明，在真核細(xì)胞中很多新合成的蛋白質(zhì)分子很快就進(jìn)入了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔中被保護(hù)起來(lái)。隨后，蛋白質(zhì)可以通過(guò)特定的分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。Blobel的“信號(hào)假說(shuō)”認(rèn)為在新生肽鏈上最初形成的一些氨基酸具有信號(hào)功能，決定了相應(yīng)的蛋白質(zhì)是否被分泌。經(jīng)過(guò)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)新生肽鏈進(jìn)入分泌途徑是在其N(xiāo)端的信號(hào)肽引導(dǎo)下完成的。當(dāng)合成的肽鏈長(zhǎng)度為大約70個(gè)氨基酸殘基時(shí)，最先被翻譯出來(lái)的N-末端序列作為“信號(hào)序列”伸出核糖體，并被存在于細(xì)胞液中的所謂“信號(hào)識(shí)別顆?！保╯ignal recognition partical，SRP）所特異結(jié)合，同時(shí)新生肽鏈的合成也暫時(shí)停止。然后所形成的復(fù)合體再與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的所謂SRP受體特異識(shí)別和結(jié)合。之后，信號(hào)識(shí)別顆粒及其受體將脫離核糖體，同時(shí)，新生肽鏈進(jìn)入存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)位子打開(kāi)的通道中。這時(shí)，新生肽鏈的合成重新啟動(dòng)，合成的新生肽鏈加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，并在信號(hào)肽被切除后，在分子伴侶的作用下折疊成其天然構(gòu)象。

以SRP為中介，信號(hào)肽依靠中間肽段的疏水性，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂質(zhì)雙層相互作用，在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，核糖體進(jìn)一步與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，隨后新生肽鏈通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的特定通道，即轉(zhuǎn)位器。轉(zhuǎn)位器為圓柱形的寡聚體，為一親水性通道，最小的轉(zhuǎn)位器有SRP受體、Sec61p復(fù)合物和一個(gè)轉(zhuǎn)位器相關(guān)膜蛋白（TRAM）組成。一旦信號(hào)肽序列從核糖體上伸出，還在延伸的、仍與核糖體結(jié)合的新生肽鏈的信號(hào)肽和SRP結(jié)合，SRP與其受體結(jié)合；帶有新生肽鏈的核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合，保證新生肽鏈準(zhǔn)確無(wú)誤的附著并進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)位器正常狀態(tài)下處于關(guān)閉狀態(tài)，只有當(dāng)核糖體與轉(zhuǎn)位器正確對(duì)位接觸后，轉(zhuǎn)位器的中央通道與核糖體大亞基的中央通道對(duì)齊，信號(hào)肽觸發(fā)轉(zhuǎn)位器瞬間開(kāi)放，延伸中的新生肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。另一方面，SRP在新生肽鏈轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過(guò)程中起中介作用，一旦新生肽鏈進(jìn)入轉(zhuǎn)位器中，它就和其受體分離，重新游離于細(xì)胞質(zhì)中，再次與新生肽鏈的信號(hào)肽結(jié)合，在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，通過(guò)SRP的循環(huán)運(yùn)作，新生肽鏈源源不斷地被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。

圖7-8　蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核和輸出細(xì)胞核

A．帶有入核信號(hào)的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的過(guò)程；B．輸出蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的過(guò)程

由于信號(hào)肽序列不存在于成熟蛋白質(zhì)分子中，因此，只能從細(xì)胞內(nèi)分離出不成熟的新生肽鏈，然后測(cè)定它們N-末端的氨基酸序列，經(jīng)比較研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分泌蛋白新生肽鏈N端信號(hào)肽序列并沒(méi)有很高的同源性，但也有一些規(guī)律：長(zhǎng)度一般為16～30個(gè)氨基酸殘基；含有1個(gè)或多個(gè)堿性氨基酸殘基；隨后是6～12個(gè)疏水性氨基酸殘基。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)分子根據(jù)各自結(jié)構(gòu)中所攜帶的信號(hào)的不同可以有以下去向：①通過(guò)高爾基體和運(yùn)輸小泡而被調(diào)節(jié)性地（如胰島細(xì)胞中的胰島素、胰島細(xì)胞中的胰高血糖素、胰島腺泡細(xì)胞中的各種蛋白酶原、乳腺細(xì)胞中的酪蛋白和乳白蛋白等）或非調(diào)節(jié)性地（如肝細(xì)胞中的白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白、淋巴細(xì)胞中的免疫球蛋白、成纖維細(xì)胞中的膠原蛋白和粘連蛋白等）運(yùn)送到細(xì)胞外面去；②通過(guò)運(yùn)輸小泡被運(yùn)送到溶酶體中（各種酸性水解酶）；③先輸送到高爾基體，然后再通過(guò)運(yùn)輸小泡回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。

除了上述途徑外，新生肽鏈還可以通過(guò)另一種不依賴SRP的途徑進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

（四）過(guò)氧化物酶體蛋白

過(guò)氧化物酶體蛋白是真核細(xì)胞中除去細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化氫的細(xì)胞器，此外還有一些脂質(zhì)、固醇、嘌呤，也在此細(xì)胞器中降解，因此，從某種意義上講，它是一個(gè)與生物降解有關(guān)的細(xì)胞器。其中含有進(jìn)行脂肪酸氧化的所有酶，以及將過(guò)氧化氫分解成水的過(guò)氧化氫酶。研究發(fā)現(xiàn)，所有過(guò)氧化物酶體基質(zhì)中的蛋白以及膜蛋白都是在細(xì)胞液中自由核糖體上合成后，經(jīng)過(guò)折疊形成了天然空間構(gòu)象再被轉(zhuǎn)運(yùn)的。

目前，在此類(lèi)蛋白質(zhì)分子上已經(jīng)鑒定出了兩類(lèi)較為普遍存在的信號(hào)肽段。一類(lèi)是過(guò)氧化氫酶、脂肪酰輔酶A氧化酶、尿酸鹽氧化酶等蛋白的C-末端都存在的一保守SKL序列，這個(gè)由3個(gè)氨基酸殘基組成的序列對(duì)于蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入過(guò)氧化物酶體而言是必需和充分的，但必須是位于C-末端；另一類(lèi)是在N-末端的SKL序列，如硫解酶，兩類(lèi)都與過(guò)氧化酶體膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白受體（分別為PTS1R和PTS2R）結(jié)合，通過(guò)受體介導(dǎo)途徑進(jìn)入過(guò)氧化物酶體，而且在蛋白進(jìn)入后信號(hào)肽序列也不會(huì)被切除。

（五）各種膜蛋白的插入和定位

在細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)膜上都定位著很多蛋白質(zhì)，存在于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、真核細(xì)胞質(zhì)膜、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基復(fù)合體膜、溶酶體膜等膜蛋白是從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)入后再轉(zhuǎn)運(yùn)到這些膜上的。蛋白質(zhì)在膜上的定位方式有兩種：一種是通過(guò)肽鏈穿越膜而定位，這些蛋白不是隨機(jī)地插入膜上的，而是具有特定位向的，即其N(xiāo)-末端或者位于細(xì)胞膜上的一側(cè)，而C-末端卻位于另一側(cè)。很多這樣的膜蛋白是通過(guò)一個(gè)螺旋跨膜的，比如在紅細(xì)胞質(zhì)膜上含量豐富的血型糖蛋白，在肝細(xì)胞膜上的低密度脂蛋白受體等；另一種是在肽鏈中的某些氨基酸殘基接上了疏水的脂質(zhì)分子，依靠脂質(zhì)分子的牽引定位在膜上，插入膜中的脂質(zhì)分子僅在膜質(zhì)的一層，或是外層一側(cè)，或是內(nèi)層一側(cè)。

穿膜蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)肽段的穿膜機(jī)制主要是利用N端的信號(hào)肽作為穿膜的起始信號(hào)，在新生肽鏈的另一肽段作為穿越膜的終止信號(hào)，一是作為終止信號(hào)的肽段進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，蛋白質(zhì)就定位于膜上了，起始信號(hào)和終止信號(hào)區(qū)域幾乎都是疏水性氨基酸相對(duì)集中的肽段，隨著新生肽鏈的延長(zhǎng)，新合成的肽段就留在胞質(zhì)中了。如果新生肽鏈中存在多個(gè)穿越膜的起始信號(hào)和終止信號(hào)，這樣的肽鏈可以多次穿越膜。不過(guò)，有一些穿膜蛋白質(zhì)的起始信號(hào)并不是N端的信號(hào)肽，二是新生肽鏈內(nèi)部的一個(gè)肽段，如果這段信號(hào)肽的C端堿性氨基酸殘基較多，帶有正電荷，得到的是Ⅰ型膜蛋白；反之如果這段信號(hào)肽的N端帶正電荷，穿膜后得到的是Ⅱ型膜蛋白，肽鏈的N端在細(xì)胞質(zhì)中，而其C端的部分或是在細(xì)胞外，或是在一些細(xì)胞器的腔面一側(cè)。

膜上的蛋白質(zhì)還可通過(guò)共價(jià)連接的糖基磷脂酰肌醇插入質(zhì)膜表面。這類(lèi)蛋白質(zhì)以Ⅰ型膜蛋白的前體形式被合成，然后，在酶的催化下發(fā)生轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，將前體肽鏈的C端部分的疏水肽段留在質(zhì)膜中，其余的大部分肽鏈轉(zhuǎn)移到已經(jīng)合成的糖基磷脂酰肌醇衍生物中的乙醇胺的氨基上，從而使蛋白質(zhì)的肽鏈通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨定在質(zhì)膜外表面。

膜上的蛋白質(zhì)可以在肽鏈中的某些氨基酸殘基上接疏水的脂肪鏈，利用脂肪鏈牽引定位蛋白質(zhì)于膜上。

（六）激光共聚焦技術(shù)

由于在細(xì)胞中，不同的亞細(xì)胞腔室結(jié)構(gòu)將不同相關(guān)功能的蛋白質(zhì)分隔在不同的區(qū)域，使用傳統(tǒng)的酵母雙雜交、pull down、Co-IP等方法均打破了這些腔室結(jié)構(gòu)，使原本空間分布不同的蛋白質(zhì)能夠自由地相互作用，因而對(duì)蛋白質(zhì)功能性相互作用分析帶來(lái)了一定的假陽(yáng)性率。在我們實(shí)驗(yàn)室的工作中，就曾經(jīng)碰到過(guò)這樣的現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)酵母雙雜等方法檢測(cè)結(jié)果都是陽(yáng)性的兩個(gè)蛋白，在完整的細(xì)胞中卻完全無(wú)法共定位。為了確認(rèn)這些蛋白質(zhì)相互作用是否在細(xì)胞中真實(shí)存在，我們必須進(jìn)一步地采用對(duì)兩種蛋白亞細(xì)胞共定位分析的方法來(lái)進(jìn)行確認(rèn)。在蛋白亞細(xì)胞定位手段方面，傳統(tǒng)的免疫電鏡雙標(biāo)記方法雖然能夠非常精確地反映不同蛋白在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的精確定位，但是這種方法不僅技術(shù)上有一定困難，操作也相對(duì)復(fù)雜，并且需要很長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)成本也相對(duì)很高。而傳統(tǒng)的免疫熒光標(biāo)記的方法是通過(guò)用熒光標(biāo)記的抗體來(lái)標(biāo)記目的蛋白，雖然也可以得到細(xì)胞中蛋白的大致分布狀況，但是得到的圖像是整個(gè)細(xì)胞中熒光信號(hào)的疊加，得不到較高的分辨率，而且由于受制于倒置熒光相差顯微鏡的分辨率，這樣的方法并不適合用于細(xì)胞內(nèi)蛋白共定位的研究。此外，用熒光基團(tuán)融合蛋白的方法也面臨同樣的問(wèn)題。所以，建立在傳統(tǒng)免疫熒光以及融合蛋白技術(shù)上的激光共聚焦技術(shù)驗(yàn)證蛋白亞細(xì)胞共定位已經(jīng)成為研究者們的最佳選擇。

1．激光共聚焦技術(shù)原理 共聚焦顯微鏡的原理在20世紀(jì)50年代就已經(jīng)被人提出，而真正的激光共聚焦顯微鏡誕生于1987年。20世紀(jì)80年代以來(lái)，激光共聚焦技術(shù)不斷發(fā)展完善，成為研究生物細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用的一個(gè)強(qiáng)有力的新技術(shù)。與傳統(tǒng)顯微鏡不同的是，激光共聚焦顯微鏡采用激光作為光源，激發(fā)標(biāo)記在目的蛋白上的熒光基團(tuán)，采用共軛聚焦原理和裝置并通過(guò)CCD來(lái)收集熒光信號(hào)，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)處理從而得到單一層面或者多重層面甚至立體的圖像。

激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)會(huì)聚透鏡和針孔，在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)通分色反射鏡時(shí)光束偏轉(zhuǎn)90°，然后經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)基團(tuán)在相應(yīng)波長(zhǎng)激光的激發(fā)下沿各個(gè)方向發(fā)射特定波長(zhǎng)的熒光，其中一部分熒光經(jīng)過(guò)物鏡、長(zhǎng)通分色反射鏡，會(huì)聚在聚焦物鏡的焦點(diǎn)處，再通過(guò)焦點(diǎn)處的針孔，由檢測(cè)器CCD接收。這樣只有在物鏡的焦平面上發(fā)出的熒光才能夠到達(dá)檢測(cè)器，而其他位置發(fā)出的熒光均不能過(guò)針孔。由于不同的熒光基團(tuán)其激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射熒光波長(zhǎng)都有其不同的特性，通過(guò)用不同的激發(fā)光波長(zhǎng)并采集不同波長(zhǎng)的信號(hào)，就能夠區(qū)分來(lái)自于不同熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)。因?yàn)槲镧R和會(huì)聚透鏡的焦點(diǎn)在同一光軸上，所以這種方式成像的顯微鏡被稱(chēng)為共聚焦顯微鏡。在激光共聚焦顯微鏡成像過(guò)程中針孔起著關(guān)鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定了是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍熒光顯微鏡掃描方式成像，而且對(duì)圖像的對(duì)比度和分辨率有重要的影響。激光依設(shè)定程序?qū)悠繁粰z區(qū)域進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，從針孔處得到該點(diǎn)的共聚焦圖像，并進(jìn)行記錄。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析來(lái)得到單一焦平面的高分辨率圖像，這就為我們?cè)阽R下觀測(cè)熒光標(biāo)記蛋白的亞細(xì)胞的精確定位以及其與其他蛋白的共定位情況提供了可能。與此同時(shí)，我們可以通過(guò)設(shè)定程序由計(jì)算機(jī)控制的載物臺(tái)升降來(lái)取得一系列焦平面上的圖像信號(hào)，這樣的數(shù)據(jù)被稱(chēng)為層疊圖像（stack images）。這樣的數(shù)據(jù)能夠更為全面地描述蛋白在細(xì)胞中的定位，而且根據(jù)層疊圖像，還可以通過(guò)計(jì)算機(jī)處理得到蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的三維分布圖像，這樣的表示方式更加直觀生動(dòng)（圖7-9）。事實(shí)上，不同焦平面上信號(hào)的相互干擾還是能夠?qū)ξ覀冏詈蟮某上裥Чa(chǎn)生不利的影響，最新開(kāi)發(fā)出來(lái)的軟件能夠通過(guò)對(duì)層疊圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析來(lái)消除這樣的影響，得到更為銳化的圖像，來(lái)為我們進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷提供幫助。有了清晰的圖像，我們不但可以通過(guò)圖像疊加直觀地觀察不同蛋白在細(xì)胞中共定位的情況，還可以通過(guò)計(jì)算機(jī)分析得到其共定位的數(shù)據(jù)，為進(jìn)行比較提供了參考。

圖7-9　激光共聚焦顯微鏡原理

在具體的實(shí)驗(yàn)工作中如何對(duì)目的蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記是我們實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)步驟最簡(jiǎn)單而且成本最低的方法是在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)與綠色熒光蛋白GFP、黃色熒光蛋白YFP等熒光蛋白基團(tuán)融合的蛋白，然后通過(guò)檢測(cè)融合蛋白的熒光基團(tuán)信號(hào)來(lái)檢測(cè)多種蛋白在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，從而得到不同蛋白的共定位信息。還有研究者通過(guò)對(duì)已有的熒光蛋白進(jìn)行一系列的突變得到一系列不同顏色的熒光蛋白，為我們?cè)谘芯恐刑峁┝烁嗟倪x擇。但是由于最新的研究中發(fā)現(xiàn)，這些分子量較大的熒光基團(tuán)會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位產(chǎn)生一定影響，所以目前的趨勢(shì)是傳統(tǒng)的免疫熒光標(biāo)記法更為研究人員所廣泛使用。免疫熒光標(biāo)記法使用不同熒光標(biāo)記的抗體來(lái)識(shí)別內(nèi)源性的蛋白質(zhì)或者過(guò)表達(dá)的帶標(biāo)簽（tag）的蛋白質(zhì)來(lái)顯示其在亞細(xì)胞中的定位。其中使用內(nèi)源性抗體來(lái)對(duì)蛋白進(jìn)行標(biāo)記的方法更能反映在生理?xiàng)l件下蛋白在細(xì)胞中的真實(shí)分布。所以如果有高質(zhì)量的抗體的情況下，我們應(yīng)該首先選用這樣的方法。熒光標(biāo)記物可以通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方法直接標(biāo)記在一抗上，也可以通過(guò)熒光標(biāo)記的二抗來(lái)識(shí)別一抗從而反映目的蛋白的分布。因?yàn)闃?biāo)記一抗對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)者有一定的難度，而且放大效率也不及熒光標(biāo)記的二抗的方法高，所以我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中通常采取先用一抗來(lái)識(shí)別內(nèi)源性的蛋白質(zhì)或者過(guò)表達(dá)的帶標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，再用商品化熒光標(biāo)記好的二抗來(lái)識(shí)別一抗的方法，來(lái)對(duì)目的蛋白進(jìn)行標(biāo)記。

2．激光共聚焦技術(shù)應(yīng)用

（1）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染帶小標(biāo)簽融合蛋白的免疫熒光定位法：由于過(guò)表達(dá)融合大型熒光蛋白基團(tuán)的方法有可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，而在研究過(guò)程中，很多時(shí)候我們研究的是新基因而往往沒(méi)有可用的抗體，所以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)的帶較小標(biāo)簽（tag）的融合蛋白法經(jīng)常被用來(lái)檢測(cè)兩種蛋白的共定位情況。常用的小標(biāo)簽有HA、MYC、FLAG、V5、His等，它們相對(duì)GFP等熒光基團(tuán)有著很小的分子量（一般小于5ku），所以基本不會(huì)影響蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，而且都有相應(yīng)的高質(zhì)量商品化抗體能夠高效特異地識(shí)別融合蛋白。它們的融合方式也有多種選擇，一般HA、MYC、V5、His在常用載體中被融合在C端，而FLAG被常用載體融合在N端，在我們實(shí)驗(yàn)室的工作中，即使有的標(biāo)簽V5被放在蛋白質(zhì)的中間區(qū)段，抗體都能夠有效識(shí)別。具體的融合方式要根據(jù)不同蛋白質(zhì)區(qū)段對(duì)細(xì)胞亞細(xì)胞定位的可能影響來(lái)選擇，如生物信息學(xué)分析N端有信號(hào)肽的，就應(yīng)該將標(biāo)簽融合在C端，如果相互作用發(fā)生在C端的就可以把標(biāo)簽融合在N端，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)事實(shí)上這類(lèi)小標(biāo)簽對(duì)蛋白亞細(xì)胞定位的影響非常小，一般不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而且在蛋白質(zhì)功能的細(xì)胞和分子生物學(xué)研究工作中帶著這些標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒幾乎一定會(huì)被用到，一般不用再次專(zhuān)門(mén)構(gòu)建。需要提到的是，HA和V5市售抗體一般只有鼠源單抗，MYC、FLAG則可以買(mǎi)到鼠源單抗和兔源多抗。當(dāng)同時(shí)使用兩種標(biāo)簽蛋白的時(shí)候要注意抗體種屬的適當(dāng)搭配，以方便選用合適的二抗來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。最常用的標(biāo)記物為綠色的FITC（異硫氰酸熒光素）和紅色TRITC（羅丹明）。

常用以下的表達(dá)克隆和抗體的組合來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：Protein A-V5～mouse IgG-anti-V5～goat-anti-mouse IgG-TRITC；Protein B-MYC～rabbit IgG-anti-MYC～goat-anti-rabbitIgGFITC。其免疫熒光原理（圖7-10）如下。

圖7-10　免疫熒光原理

在激光共聚焦顯微鏡觀察的過(guò)程中，先使用DAPI作為標(biāo)記選取合適的焦平面。然后找到兩種熒光信號(hào)都較強(qiáng)的細(xì)胞。注意：只有明亮的紅綠信號(hào)才能認(rèn)為是陽(yáng)性信號(hào)，對(duì)其進(jìn)行圖像采集。因?yàn)榧す夤簿劢癸@微鏡逐點(diǎn)掃描特定焦平面的各點(diǎn)，所以在目鏡下弱的信號(hào)一般都很難被采集到，如果信號(hào)實(shí)在很弱，則需要改善染色的條件以滿足觀察的需要。可根據(jù)操作手冊(cè)的指導(dǎo)來(lái)對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化，來(lái)取得最佳采集效果，一般的軟件都給出了FITC和TRITC的預(yù)設(shè)置信息，如果采用特殊的標(biāo)簽，還應(yīng)根據(jù)其激發(fā)特性來(lái)對(duì)圖像采集進(jìn)行設(shè)置。選中了目的區(qū)域后，建議采集層疊系列圖片（stack images）作為數(shù)據(jù)保存，從有熒光信號(hào)開(kāi)始，到熒光信號(hào)結(jié)束從縱軸上采集的一系列圖像相當(dāng)于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了系列焦平面信號(hào)采集。這樣雖然需要更多的時(shí)間來(lái)進(jìn)行采集，但是得到的數(shù)據(jù)一方面可以用于制作3D圖像，一方面還可以用于通過(guò)軟件分析排除近鄰焦平面上相關(guān)信號(hào)的干擾，還可以對(duì)于目標(biāo)蛋白在整個(gè)細(xì)胞中的分布來(lái)進(jìn)行分析。如果只需要一個(gè)圖片也可以從一系列圖片中選取最好的。通過(guò)軟件分析來(lái)得到目的圖片。一般需要給出紅（TRITC）、綠（TRITC）、藍(lán)（DAPI）3個(gè)通道的圖像和重合的圖像，并附上標(biāo)尺，方便我們判斷兩種蛋白是否共定位。通過(guò)軟件分析還能得到兩種蛋白共定位的比例數(shù)據(jù)。

（2）使用抗體檢測(cè)細(xì)胞中內(nèi)源性蛋白的亞細(xì)胞定位法：在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，即使采用過(guò)表達(dá)標(biāo)簽抗體的方法，同樣會(huì)遇到不能正確反映蛋白質(zhì)在細(xì)胞中正確的亞細(xì)胞定位的現(xiàn)象。因?yàn)樗矔r(shí)過(guò)表達(dá)的大量標(biāo)簽蛋白很容易聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等蛋白加工修飾的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)區(qū)域，這樣的情況下，就會(huì)使我們對(duì)蛋白質(zhì)的共定位不能準(zhǔn)確判斷。所以有必要使用抗體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中內(nèi)源性蛋白的亞細(xì)胞定位，這個(gè)方法實(shí)際操作相對(duì)來(lái)說(shuō)是最簡(jiǎn)單的，也是最可靠的。關(guān)鍵在于必須要有針對(duì)細(xì)胞內(nèi)源蛋白的高質(zhì)量抗體。自己制備的抗體要進(jìn)行Western實(shí)驗(yàn)確認(rèn)識(shí)別條帶的特異性，并經(jīng)過(guò)免疫熒光染色的預(yù)實(shí)驗(yàn)才能夠使用。即使是商品化的抗體，也有很多不適宜用來(lái)進(jìn)行免疫熒光染色，因?yàn)橛捎诘鞍踪|(zhì)的折疊很有可能使被抗體識(shí)別的表位無(wú)法暴露，而在Western實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)變性，則不存在這樣的問(wèn)題。商品化的抗體如果能用來(lái)做免疫熒光使用，則可以在說(shuō)明書(shū)上看到詳細(xì)的說(shuō)明，有的還會(huì)給出參考圖片以及使用過(guò)該抗體的參考文獻(xiàn)，選購(gòu)的時(shí)候要注意仔細(xì)參考對(duì)比，選取效果最好的。另外還要注意抗體的亞型和種屬。一般最好選用IgG的抗體，因?yàn)獒槍?duì)IgM等其他亞型抗體的二抗使用不多，很多國(guó)內(nèi)公司不提供，國(guó)外的價(jià)格又很高。兩種不同的蛋白一抗必須來(lái)源于不同的種屬，例如采用rabbit IgG anti ProteinA＋Goat IgG anti rabbit IgG（FITC）或mouse IgG anti ProteinB＋Goat IgG anti mouse IgG（TRITC）的組合方式。在共定位實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，有必要使用抗體對(duì)所用細(xì)胞株內(nèi)源性蛋白進(jìn)行Western檢測(cè)，來(lái)確定兩種目的蛋白在所選擇的細(xì)胞株中都有內(nèi)源性表達(dá)，并且要進(jìn)行免疫熒光染色預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確?？贵w可用。本方法中選擇高質(zhì)量的抗體和合適的細(xì)胞株是成功的關(guān)鍵。當(dāng)然，也可以使用組織切片進(jìn)行驗(yàn)證。

（3）基于亞細(xì)胞定位的活細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用驗(yàn)證——熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)系統(tǒng)（FRET）：根據(jù)前述介紹的使用熒光融合蛋白標(biāo)記驗(yàn)證共定位的方法，研究者們又進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)系統(tǒng)（FRET）法，用于驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用，這種方法甚至可以在活細(xì)胞中進(jìn)行。

對(duì)空間距離接近的合適熒光物質(zhì)可以構(gòu)成一個(gè)能量供體受體對(duì)（例如CFP／YFP），激發(fā)供體分子的能量傳遞給受體，而后受體發(fā)射光子。被不同熒光標(biāo)記的兩個(gè)蛋白，如果熒光基團(tuán)供受體在合適的距離內(nèi)（1～10nm），可以用供體的激發(fā)光激發(fā)，供體產(chǎn)生的熒光比原來(lái)單獨(dú)存在時(shí)低很多，而受體產(chǎn)生的熒光則會(huì)大大增強(qiáng)，同時(shí)它們的熒光壽命也會(huì)相應(yīng)縮短和變長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)這種效應(yīng)在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行測(cè)定從而對(duì)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的共定位以及相互作用進(jìn)行確定。這樣的方法同樣存在熒光基團(tuán)的分子量大小不可忽略的問(wèn)題。由于通常使用過(guò)表達(dá)的熒光蛋白融合蛋白，經(jīng)過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相互作用的蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的FRET假陽(yáng)性很難避免。雖然可以通過(guò)一系列的對(duì)照來(lái)消除一些假陽(yáng)性的信號(hào)，但是相對(duì)較高的假陽(yáng)性率限制了FRET技術(shù)的廣泛應(yīng)用，雖然很多公司都提供了相應(yīng)的宣傳信息，但是在已經(jīng)發(fā)表的有關(guān)蛋白質(zhì)相互作用的研究工作中很少有報(bào)道。熒光基團(tuán)間的距離也有可能成為制約FRET技術(shù)的因素，熒光基團(tuán)的融合方式（N端／C端）也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的效果產(chǎn)生影響。但是，對(duì)于一些弱的和瞬時(shí)的尤其是只在細(xì)胞甚至是活細(xì)胞內(nèi)存在的相互作用，F(xiàn)RET技術(shù)則有著無(wú)法替代的優(yōu)越性，隨著技術(shù)的不斷完善，相信一定會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。