細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。從供體獲取組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)（primary　culture）。原代細(xì)胞離體時(shí)間短，具有二倍體遺傳性，在一定程度上反映了體內(nèi)生長(zhǎng)的特性，很適合作藥物測(cè)試、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定的密度后，則需要做再培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，從一個(gè)容器以1∶2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)（passage　culture）。傳代培養(yǎng)的次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)。

一、原代細(xì)胞培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作最基本的技術(shù)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皩?shí)驗(yàn)材料，解離或分離的方法和條件各不同。一般常用方法有二：組織塊培養(yǎng)法及單層細(xì)胞培養(yǎng)法。

（一）單層細(xì)胞培養(yǎng)法

【實(shí)驗(yàn)用品】

1．器材　超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、普通顯微鏡、倒置相差顯微鏡、水浴箱、離心機(jī)、解剖剪、解剖鑷、眼科剪、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管、吸管、移液管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、橡皮吸頭、篩網(wǎng)、酒精燈、試管架、酒精瓶、棉球、無(wú)菌服、口罩、帽子等。

2．試劑　RPMI－1640培養(yǎng)液（含小牛血清和青霉素、鏈霉素）、0．25%胰蛋白酶消化液、Hanks液。

3．材料　新生乳鼠。

所有組織都含有一定量的細(xì)胞間質(zhì)（纖維、基質(zhì)等），妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)。用酶消化后，能除去間質(zhì)，使組織容易分離成單個(gè)細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)，接種后細(xì)胞易于生長(zhǎng)。下面以胰蛋白酶消化法原代培養(yǎng)初生乳鼠肺組織為例加以說(shuō)明。

【操作步驟】

1．取材　取新生乳鼠1只，斷髓處死，將尾巴提起，鼠身浸入裝有75%乙醇的燒杯中3s，取出放置在滅菌的培養(yǎng)皿中移入工作臺(tái)內(nèi)。無(wú)菌操作取材。用碘酒、75%乙醇消毒胸廓部位皮膚。在胸廓正中線中位處，用彎頭眼科鑷夾起腹部皮膚，剪開腹腔和胸腔，并剪去部分胸壁以充分暴露胸腔，用眼科鑷輕輕夾起粉紅色肺組織并剪下放入另一培養(yǎng)皿中。用Hanks液清洗，去掉血污。

2．消化與分散組織塊　把組織塊移入無(wú)菌的青霉素瓶中并置于一角，用眼科直剪反復(fù)剪切組織成1mm3大小的小塊，此過(guò)程需15min，再用Hanks液洗滌2或3次，至液體澄清方可。棄去Hanks液，加入5～10倍體積的0．25%胰蛋白酶溶液（pH7．4～7．8），蓋好橡皮塞，置37℃水浴中消化20～30min，消化時(shí)每隔5min搖動(dòng)一次，使組織塊散開。視組織塊變得疏松顏色略變白時(shí)，從水浴中取出，在超凈工作臺(tái)中用吸管輕輕吸去消化液，加入2～3ml完全培養(yǎng)基（血清中含有胰蛋白酶抑制劑），以終止消化。然后用吸管反復(fù)吹打，使大部分組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，靜置片刻，讓未被消化完的組織自然下沉，然后將上層細(xì)胞懸液移入無(wú)菌離心管中備用。也可使細(xì)胞懸液通過(guò)篩網(wǎng)，以去除細(xì)胞混懸液中的細(xì)胞團(tuán)，收集過(guò)篩網(wǎng)的單細(xì)胞懸液。

3．細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力測(cè)定　離心管平衡后以800g離心5min，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打混勻后取樣計(jì)數(shù)和進(jìn)行活率測(cè)定。細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力測(cè)定方法見(jiàn)第3章第二節(jié)。

4．接種培養(yǎng)　在培養(yǎng)瓶的側(cè)面做好標(biāo)記：培養(yǎng)物的名稱、組號(hào)和日期。接種時(shí)，在25ml培養(yǎng)瓶中先加入1．5ml培養(yǎng)液，再接種1ml細(xì)胞懸液，用吸管輕輕混勻細(xì)胞后加蓋瓶塞。持瓶做上下、左右十字形晃動(dòng)后，移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中開放培養(yǎng)。接種細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞類型、活力有關(guān)，單層細(xì)胞培養(yǎng)接種濃度一般為1×105～1×106／ml細(xì)胞懸液。細(xì)胞活力好的，細(xì)胞接種數(shù)可少一些；胚胎細(xì)胞接種數(shù)較少，而分化程度高的二倍體細(xì)胞接種濃度要高些。

（二）組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用的簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。把組織塊切割成0．5～1mm3的小塊后，由于組織塊體積很小，在不加任何黏著劑的情況下，它們也能貼附于瓶壁上，然后細(xì)胞自組織塊邊緣向外長(zhǎng)出生長(zhǎng)暈，最后連接成片形成單層細(xì)胞。

【實(shí)驗(yàn)用品】　同（一）單層細(xì)胞培養(yǎng)法。

【操作步驟】

1．取材　從動(dòng)物體內(nèi)取材方法與單層細(xì)胞培養(yǎng)取材相同。將取出的組織（肝、腎或肺）移入無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，用Hanks液沖洗，去除血污。把組織塊移入無(wú)菌的青霉素瓶中并置于一角，用眼科直剪反復(fù)剪切組織成0．5～1mm3的小塊，再用吸管加2或3滴細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打，使組織塊懸浮在培養(yǎng)液中。

2．接種培養(yǎng)　用吸管分次吸取組織塊懸液，吸取時(shí)注意讓組織塊吸在吸管端部，以免吸得過(guò)高，黏附管壁而丟失。將組織塊均勻排在培養(yǎng)瓶底壁上，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入2～3ml培養(yǎng)液，塞緊瓶塞，做好標(biāo)記置于37℃培養(yǎng)箱中2～3h后，待組織塊略干燥能牢固貼于瓶壁上時(shí)，再緩慢地將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液浸泡組織塊，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。

3．觀察　靜止培養(yǎng)2～3d后，每天小心取出培養(yǎng)瓶置于倒置相關(guān)顯微鏡下觀察，已貼壁的組織塊邊緣有細(xì)胞長(zhǎng)出。隨后逐漸出現(xiàn)細(xì)胞分裂，細(xì)胞數(shù)量增多?？筛鶕?jù)培養(yǎng)液顏色變化，補(bǔ)加和更換培養(yǎng)液，同時(shí)注意吸除漂浮的組織塊。細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，10～15d可長(zhǎng)成致密單層，這時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

二、細(xì)胞傳代培養(yǎng)

代培養(yǎng)細(xì)胞在瓶壁匯合后，需進(jìn)行分離再培養(yǎng)，否則正常細(xì)胞因生存空間不足或細(xì)胞密度過(guò)大，致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不足而引起細(xì)胞衰老、停止生長(zhǎng)甚至死亡。為了維持細(xì)胞的存活與生長(zhǎng)，必須將原代培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞分離、稀釋接種到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)即傳代培養(yǎng)。貼附型細(xì)胞與懸浮型細(xì)胞傳代方式不同：貼附型細(xì)胞用酶消化方法傳代，而懸浮型細(xì)胞可直接或離心傳代。

【實(shí)驗(yàn)用品】

1．器材　普通顯微鏡、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)瓶、離心管、吸管、移液管、橡皮吸頭、酒精燈、試管架、乙醇瓶、棉球等。

2．試劑　RPMI－1640培養(yǎng)液（含小牛血清和青、鏈霉素）、0．25%胰蛋白酶消化液、Hanks液。

3．材料　原代培養(yǎng)的乳鼠肺細(xì)胞。

【操作步驟】

1．貼壁細(xì)胞的傳代

（1）洗細(xì)胞：取已生長(zhǎng)成致密單層的乳鼠原代培養(yǎng)肺細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，加入2～3ml Hanks液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞后傾去，以去除殘留的血清和衰老脫落的細(xì)胞及其碎片。

（2）消化：加入適量胰蛋白酶消化液浸泡細(xì)胞表面，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)大部分細(xì)胞變成圓球形、細(xì)胞成片收縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)可倒去消化液，加基礎(chǔ)培養(yǎng)液或Hanks　1ml終止消化，用吸管有序地吹打瓶壁細(xì)胞，將消化下來(lái)的細(xì)胞于離心管中800g離心5min以去除酶液。

（3）接種：離心沉淀細(xì)胞后加海里完全培養(yǎng)液，混勻，分別接種到2～3個(gè)新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。每瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液至5ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：消化液作用多層細(xì)胞時(shí)，鏡下出現(xiàn)蜘蛛網(wǎng)狀時(shí)，立即終止消化；加消化液后，若2min內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞脫落時(shí)，示消化過(guò)頭；消化過(guò)程中見(jiàn)大片細(xì)胞脫落，示消化過(guò)頭；消化過(guò)頭時(shí)切勿倒去多余消化液，需加入等量的培養(yǎng)液吹打。

2．懸浮細(xì)胞的傳代

（1）直接傳代：讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉1／3～1／2，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，再傳代。

（2）離心傳代：在超凈工作臺(tái)內(nèi)用吸管將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打均勻，尤其是將那些半貼壁的細(xì)胞吹打起來(lái)；吸入離心管中，蓋緊蓋子，與另一離心管平衡后800g離心5min；回到超凈工作臺(tái)內(nèi)，棄去上清液，加入適量新培養(yǎng)液，用吸管打勻，制成懸液后接種培養(yǎng)。

（3）若只為了保留細(xì)胞，則吸取少量細(xì)胞懸液至另一瓶中，加入適量新培養(yǎng)液即可，不必經(jīng)離心步驟。

三、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

長(zhǎng)期傳代的細(xì)胞在暫時(shí)不用時(shí)可以用低溫冷凍的方法保存，復(fù)蘇后仍然可保持其原有的生物學(xué)特性和增殖活性。

【實(shí)驗(yàn)用品】

1．器材　同細(xì)胞培養(yǎng)，液氮罐，無(wú)菌細(xì)胞凍存管。

2．試劑　二甲基亞砜（dimathyl　sulfoxide，DMSO），培養(yǎng)液、小牛血清、0．25%胰蛋白酶消化液。

3．材料　培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞株。

【操作步驟】

1．細(xì)胞凍存

（1）選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（必須證明無(wú)支原體污染），在收集細(xì)胞前24h換液1次。

（2）按前述方法將培養(yǎng)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)使細(xì)胞達(dá)5×106／ml左右密度，離心去上清，用1ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分裝2個(gè)無(wú)菌管。

（3）用含20%小牛血清的培養(yǎng)液配制的20%DMSO凍存液，按與細(xì)胞懸液相同的量（0．5ml）一滴一滴地加入細(xì)胞無(wú)菌細(xì)胞凍存管中（DMSO的終濃度為10%），然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞懸浮。

（4）將凍存管置入紗布袋中，標(biāo)明細(xì)胞名稱和凍存日期。

（5）將細(xì)胞凍存管置4℃冰箱30min→－20℃冰箱30min→－70℃冰箱30min→液氮表面過(guò)夜，最后投入液氮中。

2．細(xì)胞復(fù)蘇

（1）從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速放入37℃水浴1～2min，使之融化。

（2）用70%乙醇消毒管中后，用吸管吸收細(xì)胞懸液，注入離心管中再滴加5～10ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

（3）800g，離心5min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基后裝入培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。