衰老與死亡_分子生物學(xué)技術(shù)

第三節(jié)　細(xì)胞損傷、衰老與死亡

“生、老、病、死”是生命的四重奏。人類自出生總要經(jīng)過生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老直至死亡的幾個(gè)階段，這是生命的必然規(guī)律。人體是由細(xì)胞組織起來的，組成細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)在運(yùn)動(dòng)中不斷受到內(nèi)外環(huán)境的影響而發(fā)生損傷，致使人體內(nèi)某些細(xì)胞不斷地衰老與死亡。細(xì)胞的衰老與死亡是新陳代謝的自然現(xiàn)象。

一、細(xì)胞損傷

細(xì)胞損傷是許多疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷的因素包括缺氧，物理因素（機(jī)械性、高低溫、高低氣流、電流、射線等），化學(xué)因素，藥物和生物因素（細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等），營(yíng)養(yǎng)失衡，內(nèi)分泌，免疫反應(yīng)，遺傳變異，醫(yī)源性因素，心理因素等。細(xì)胞損傷可分為可逆性損傷和不可逆性損傷。第3種情況是細(xì)胞損傷后產(chǎn)生了適應(yīng)，在形態(tài)上表現(xiàn)為萎縮、肥大、增生和化生（圖1－17）。

圖1－17　細(xì)胞損傷及其反應(yīng)

1.可逆性損傷　指損傷的刺激輕微且當(dāng)去除時(shí)，所發(fā)生的細(xì)胞改變可以恢復(fù)?？赡嫘該p傷可表現(xiàn)為形態(tài)正常而功能異常的損傷，也可表現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)的改變，如非致死性缺氧細(xì)胞損傷的早期，主要表現(xiàn)為細(xì)胞水腫。因有害物導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，Na^＋和Ca^2＋進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，鉀流出，水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外，感染和中毒引起的肝的脂肪變性，血管壁及結(jié)締組織和細(xì)胞內(nèi)的玻璃樣變性、淀粉樣變性、黏液樣變性、病理性色素沉著、病理性鈣化均為細(xì)胞或組織的可逆性損傷。

2.不可逆性損傷　常常由嚴(yán)重而持續(xù)的損傷所造成的，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。不可逆性損傷表現(xiàn)有嚴(yán)重的線粒體空泡化，溶酶體腫脹和線粒體內(nèi)出現(xiàn)大的無定形致密體。特別是ATP生成的減少和細(xì)胞膜的損傷為兩個(gè)關(guān)鍵性變化。不可逆性損傷細(xì)胞的死亡有兩種形式，即壞死和凋亡，將在下面描述。

3.細(xì)胞損傷的發(fā)生機(jī)制

（1）細(xì)胞膜的損傷：細(xì)胞損傷常引發(fā)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca^2＋增加，活化細(xì)胞內(nèi)蛋白酶和磷脂酶，造成細(xì)胞骨架成分和膜磷脂的降解，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失。另外，細(xì)胞膜表面的變化會(huì)激活補(bǔ)體通路，損傷細(xì)胞膜。細(xì)胞膜損傷常導(dǎo)致膜通透性的改變，進(jìn)而引起細(xì)胞水腫和裂解。線粒體膜的損傷則會(huì)損害細(xì)胞的能量代謝。溶酶體膜的破壞將水解酶釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引發(fā)了細(xì)胞蛋白的自主消化。

（2）能量生成的破壞：細(xì)胞的代謝和生物合成都是需要能量的驅(qū)動(dòng)，能量主要以ATP形式存在于細(xì)胞內(nèi)。ATP的形成需要糖類作為原料和氧氣的供給。低糖、缺氧都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)能的降低，影響了細(xì)胞正常生存所需要的結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)的合成。同時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)能需要一系列酶的參與，損傷因素若破壞了其中關(guān)鍵酶的活性，會(huì)導(dǎo)致急性ATP缺乏，引起細(xì)胞死亡。另一方面，細(xì)胞損傷時(shí)所造成的線粒體腫脹或線粒體膜的損壞，使氧化磷酸化失偶聯(lián)，有氧呼吸不能產(chǎn)生ATP。

（3）代謝的異常：正常細(xì)胞代謝是在一系列酶和能量作用下，并以嚴(yán)格調(diào)控方式定序、定量、定位進(jìn)行的。一方面，細(xì)胞能量生成的減少和破壞，代謝酶合成的減少，酶的失活，使正常代謝受阻；另一方面，一些蛋白水解酶的釋放、有些蛋白酶的激活使細(xì)胞骨架蛋白遭受破壞，均使細(xì)胞損傷加劇。

此外許多損傷因素，特別是化學(xué)和生物因素以及射線常引發(fā)過量自由基的產(chǎn)生，包括超氧自由基和羥自由基。這些自由基非?；顫?，具有高度反應(yīng)性，與細(xì)胞重要成分發(fā)生反應(yīng)，使蛋白質(zhì)交聯(lián)和脂質(zhì)過氧化，并誘導(dǎo)DNA突變以及干擾細(xì)胞生長(zhǎng)等作用引起細(xì)胞損傷。

（4）基因的改變：輻射、致突變化學(xué)品和藥品以及病毒都可能引起DNA的損傷。DNA損傷可大致分為堿基損傷和DNA鏈損傷兩類。DNA損傷的結(jié)果：①使其復(fù)制受到影響；②基因的表達(dá)失控；③基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能異常。

基因改變對(duì)細(xì)胞的影響取決于：①損傷的嚴(yán)重程度；②損傷施與的時(shí)期；③受影響的基因性質(zhì)。不可修復(fù)的基因改變可能會(huì)導(dǎo)致病變?nèi)缒[瘤，嚴(yán)重的可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

二、細(xì)胞衰老

細(xì)胞衰老是指細(xì)胞在正常環(huán)境條件下發(fā)生的功能減退，逐漸趨向死亡的現(xiàn)象。衰老是生物界的普遍規(guī)律，細(xì)胞作為生物有機(jī)體的基本單位，也在不斷地新生和衰老死亡。衰老是一個(gè)過程，這一過程的長(zhǎng)短即細(xì)胞的壽命，它隨組織種類而不同，同時(shí)也受環(huán)境條件的影響。高等動(dòng)物體細(xì)胞都有最大分裂次數(shù)，細(xì)胞分裂一旦達(dá)到這一次數(shù)就要死亡。各種動(dòng)物的細(xì)胞最大分裂次數(shù)各不相同，人細(xì)胞為50～60次。一般說來，細(xì)胞最大分裂數(shù)與動(dòng)物的平均壽命成正比。根據(jù)人體細(xì)胞壽命情況將細(xì)胞分為3種類型：第一類，細(xì)胞的壽命接近于動(dòng)物的整體壽命，如神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等；第二類，是緩慢更新的細(xì)胞，其壽命比機(jī)體的壽命短，如肝細(xì)胞、胃壁細(xì)胞等；第三類，是快速更新的細(xì)胞，如皮膚的表皮細(xì)胞、紅細(xì)胞和白細(xì)胞等，它們?cè)谡Ｇ闆r下終身保持分裂能力或不斷由前體細(xì)胞進(jìn)行分化補(bǔ)充。細(xì)胞衰老時(shí)會(huì)出現(xiàn)水分減少、老年色素——脂褐色素累積、酶活性降低、代謝速率變慢等一系列變化。關(guān)于細(xì)胞衰老目前已有不少假說，主要包括遺傳因素學(xué)說、細(xì)胞損傷學(xué)說、生物大分子衰老學(xué)說等，有整體水平的，有器官、組織水平，也有細(xì)胞和分子水平的。都有一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但都是從一個(gè)側(cè)面來解釋衰老這一復(fù)雜現(xiàn)象，都有局限性，還不能全面地說明衰老的全過程。

1.細(xì)胞衰老的特征

（1）形態(tài)變化：衰老細(xì)胞的形態(tài)變化主要表現(xiàn)在細(xì)胞皺縮，膜通透性、脆性增加，核膜內(nèi)折，細(xì)胞器數(shù)量特別是線粒體數(shù)量減少，胞內(nèi)出現(xiàn)脂褐素等異常物質(zhì)沉積，最終出現(xiàn)細(xì)胞凋亡或壞死?？傮w來說老化細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)呈退行性變化。

（2）分子水平的變化：衰老細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)脂類、蛋白質(zhì)和DNA等細(xì)胞成分損傷，細(xì)胞代謝能力降低，主要表現(xiàn)在以下方面。①DNA：復(fù)制與轉(zhuǎn)錄受到抑制，但也有個(gè)別基因會(huì)異常激活，端粒DNA丟失，線粒體DNA特異性缺失，DNA氧化、斷裂、缺失和交聯(lián)，甲基化程度降低。②RNA：mRNA和tRNA含量降低。③蛋白質(zhì)：合成下降，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化、氨甲?；⒚摪被刃揎椃磻?yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和可消化性下降。自由基使蛋白質(zhì)肽鏈斷裂、交聯(lián)而變性；氨基酸由左旋變?yōu)橛倚?。④酶分子：活性中心被氧化，金屬離子Ca^2＋、Zn^2＋、Mg^2＋、Fe^2＋等丟失，酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、溶解度等電點(diǎn)發(fā)生改變，總的效應(yīng)是酶失活。⑤脂類：不飽和脂肪酸被氧化，引起膜脂之間或與脂蛋白之間交聯(lián)，膜的流動(dòng)性降低。

2.細(xì)胞衰老的機(jī)制：關(guān)于衰老的機(jī)制具有許多不同的學(xué)說，概括起來主要有差錯(cuò)學(xué)派和遺傳學(xué)派兩大類，前者強(qiáng)調(diào)衰老是由于細(xì)胞中的各種錯(cuò)誤積累引起的，后者強(qiáng)調(diào)衰老是遺傳決定的自然演進(jìn)過程。其實(shí)，現(xiàn)在看來兩者是相互統(tǒng)一的。

（1）差錯(cuò)學(xué)派：細(xì)胞衰老是各種細(xì)胞成分在受到內(nèi)外環(huán)境的損傷作用后，因缺乏完善的修復(fù)，使“差錯(cuò)”積累，導(dǎo)致細(xì)胞衰老。根據(jù)對(duì)導(dǎo)致“差錯(cuò)”的主要因子和主導(dǎo)因子的認(rèn)識(shí)不同，可分為不同的學(xué)說，代謝廢物積累、大分子交聯(lián)、自由基學(xué)說、線粒體DNA突變、體細(xì)胞突變與DNA修復(fù)和重復(fù)基因失活，這些學(xué)說各有實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但都不完全。

（2）遺傳學(xué)派：認(rèn)為衰老是遺傳決定的自然演進(jìn)過程，一切細(xì)胞均有內(nèi)在的預(yù)定程序決定其壽命，而細(xì)胞壽命又決定種屬壽命的差異，外部因素只能使細(xì)胞壽命在限定范圍內(nèi)變動(dòng)。其中程序性衰老理論、復(fù)制性衰老理論為遺傳學(xué)派的兩大學(xué)說，包括細(xì)胞凋亡、端粒衰老、內(nèi)分泌功能減退、中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰退、免疫衰老等學(xué)說。另外，還認(rèn)為DNA鏈上可能存在一些“長(zhǎng)壽基因”和“衰老基因”來決定個(gè)體的壽限。

三、細(xì)胞死亡

細(xì)胞死亡（cell death）的一般定義是細(xì)胞生命現(xiàn)象不可逆的停止。細(xì)胞死亡有兩種形式：一種為壞死性死亡，是由外部的化學(xué)、物理或生物因素的侵襲而造成的細(xì)胞崩潰裂解；另一種為細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下按照自身的程序結(jié)束其生存。

1.細(xì)胞壞死（necrosis）　是細(xì)胞受到外部的化學(xué)、物理或生物因素的侵襲而造成的細(xì)胞崩潰裂解，引起細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。壞死細(xì)胞的形態(tài)改變主要是由下列兩種病理過程引起的，即酶性消化和蛋白變性。參與此過程的酶，如來源于死亡細(xì)胞本身的溶酶體則稱為細(xì)胞自溶（autolysis）；若來源于浸潤(rùn)壞死組織內(nèi)白細(xì)胞溶酶體則稱為異溶（heterolysis）。由于壞死細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起周圍組織炎癥反應(yīng)。

2.細(xì)胞凋亡（cell apoptosis）　是借用古希臘語，表示細(xì)胞像秋天的樹葉一樣凋落的死亡方式。1965年澳大利亞科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎大鼠門靜脈后，電鏡觀察到肝實(shí)質(zhì)組織中有一些散在的死亡細(xì)胞，這些細(xì)胞的溶酶體并未被破壞，顯然不同于細(xì)胞壞死。這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集，從其周圍的組織中脫落并被吞噬，機(jī)體無炎癥反應(yīng)。1972年Kerr等首次提出了細(xì)胞凋亡的概念，宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡的真正探索的開始。在此之前，關(guān)于胚胎發(fā)育生物學(xué)、免疫系統(tǒng)的研究、肝細(xì)胞死亡的研究都為這一概念的提出奠定了基礎(chǔ)。

形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡的變化是多階段的，細(xì)胞凋亡往往涉及單個(gè)細(xì)胞，即便是一小部分細(xì)胞也是非同步發(fā)生的（圖1－18）。首先出現(xiàn)的是細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞質(zhì)，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為180～200bp片段，電泳呈現(xiàn)出梯狀（1adder）譜型（圖1－19）；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個(gè)凋亡小體（apoptotic body），無內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。

雖然凋亡與壞死的最終結(jié)果極為相似，但它們的過程與表現(xiàn)卻有很大差別。壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細(xì)胞體積腫脹變大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生應(yīng)答的有序變化過程。其細(xì)胞及組織的變化與壞死有明顯的不同（表1－1）。

圖1－18　細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死

圖1－19　細(xì)胞凋亡的DNA梯狀譜型

表1－1　細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的比較

細(xì)胞凋亡通常又稱為程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD），是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序性的死亡。它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，因而是具有生理性和選擇性的。它在多細(xì)胞生物的組織分化、器官發(fā)育、機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持中有著重要的意義。機(jī)體在產(chǎn)生新生細(xì)胞的同時(shí)，衰老和突變的細(xì)胞被通過凋亡機(jī)制而清除，使器官和組織得以正常地發(fā)育和代謝。細(xì)胞凋亡也參與一些病理過程，如腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染和神經(jīng)退化性疾病等。在細(xì)胞凋亡一詞出現(xiàn)之前，胚胎學(xué)家已觀察到動(dòng)物發(fā)育過程中存在著細(xì)胞程序性死亡現(xiàn)象，它是胚胎正常發(fā)育所必需的。

近年來PCD和細(xì)胞凋亡常被作為同義詞使用，但兩者實(shí)質(zhì)上是有差異的。首先，PCD是一個(gè)功能性概念，描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中，某些細(xì)胞的死亡是個(gè)體發(fā)育中一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格控制的正常組成部分，而凋亡是一個(gè)形態(tài)學(xué)概念，指與細(xì)胞壞死不同的受到基因控制的細(xì)胞死亡形式。其次，PCD的最終結(jié)果是細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞凋亡并非都是程序化的。目前一般認(rèn)為凋亡和程序性死亡兩個(gè)概念可以交互使用，具有同等意義。

3.細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制　細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控作用的結(jié)果。有很多基因參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，調(diào)控環(huán)節(jié)包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)生物合成和代謝過程等。細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因，包括一些與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因。這些基因又稱為細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，其中研究較多的有ICE、Apaf－1、bcl－2、Fas/APO－1、c－myc、p53、ATM等。這些基因在細(xì)胞凋亡過程的不同階段發(fā)揮作用。

細(xì)胞凋亡的過程大致可分為以下幾個(gè)階段：①接受凋亡信號(hào)；②凋亡調(diào)控分子間的相互作用；③蛋白水解酶（caspase）的活化；④進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程，直到細(xì)胞死亡。

（1）凋亡的啟動(dòng)階段：細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號(hào)刺激后胞內(nèi)一系列控制開關(guān)的開啟或關(guān)閉，不同的外界因素啟動(dòng)凋亡的方式不同，所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同，客觀上說對(duì)細(xì)胞凋亡過程中信號(hào)傳遞系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)還是不全面的。如果細(xì)胞外的信號(hào)促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡，則屬于死亡的正控制。若細(xì)胞外信號(hào)抑制細(xì)胞的程序性死亡，則是死亡的負(fù)控制，將這種信號(hào)稱為存活因子（survival factors）。

1）細(xì)胞凋亡的膜受體通路：細(xì)胞表面的凋亡受體是屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族的跨膜蛋白，它們包括Fas（Apo－1/CD95）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAIL－R1和DR5/TRAIL－R2。其配體屬于TNF家族，目前已比較清楚的是Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。

Fas具有3個(gè)富含半胱氨酸的胞外區(qū)和一個(gè)稱為死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）的胞內(nèi)區(qū)。Fas的配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）與Fas結(jié)合后，F(xiàn)as三聚化使胞內(nèi)的DD區(qū)構(gòu)象改變，然后與接頭蛋白FADD（Fas－associated death domain）的DD區(qū)結(jié)合，而后FADD的N端DED區(qū)（death effector domain）就能與caspase－8（或10）前體蛋白結(jié)合，形成誘導(dǎo)死亡信號(hào)復(fù)合物（death－inducing signaling complex，DISC），引起caspase－8或10通過自身剪切激活，然后它們啟動(dòng)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使caspase－3、6和7激活，這幾種caspase可降解胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

2）細(xì)胞內(nèi)信號(hào)對(duì)細(xì)胞凋亡的激發(fā)：線粒體是細(xì)胞生命活動(dòng)控制中心，它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細(xì)胞凋亡調(diào)控中心。實(shí)驗(yàn)表明了細(xì)胞色素C從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。釋放到細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1（apoptotic protease－activating factor，Apaf－1）結(jié)合，使其形成多聚體，并促使caspase－9與其結(jié)合形成凋亡小體，被激活的caspase－9能激活其他的caspase如caspase－3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

（2）細(xì)胞凋亡的執(zhí)行：盡管細(xì)胞凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚，但已了解所有的動(dòng)物細(xì)胞都有一種相類似的控制細(xì)胞凋亡的機(jī)制，即通過一個(gè)自殺性蛋白酶家族的介導(dǎo)，這種蛋白酶在誘導(dǎo)程序化死亡信號(hào)的作用下通過自我切割而激活。激活的自殺性蛋白酶又可激活家族中的其他成員，引起蛋白質(zhì)酶解的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在該反應(yīng)系統(tǒng)中，上一級(jí)的信號(hào)激活下一級(jí)的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，并快速將其水解，從而使信號(hào)得以放大。最后被激活的蛋白酶切割了細(xì)胞與程序性細(xì)胞死亡相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，如核纖層蛋白，從而快速引起有控制的細(xì)胞死亡。

級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的自殺性蛋白水解酶就是caspase，即天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，簡(jiǎn)稱胱解酶。到目前為止，至少已有14種caspase被發(fā)現(xiàn)。caspase分子間的同源性很高，結(jié)構(gòu)相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根據(jù)功能可把caspase基本分為兩類：一類參與細(xì)胞的加工，如Pro－IL－1β和Pro－IL－1δ，形成有活性的IL－1β和IL－1δ；第二類參與細(xì)胞凋亡，包括caspase－2、3、6、7、8、9和10。

參與細(xì)胞凋亡的caspase歸成兩類：一類是起始者，另一類是執(zhí)行者。起始caspase在外來蛋白信號(hào)的作用下被切割激活，激活的起始caspase對(duì)執(zhí)行者caspase進(jìn)行切割并使之激活，被激活執(zhí)行者caspase通過對(duì)caspase靶蛋白的水解，導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。

研究表明，能夠被caspase切割的靶蛋白包括以下幾種類型。

1）蛋白激酶：caspase能夠切割10多種蛋白激酶，如黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）、PKB、PKC以及Raf1。如果黏著斑激酶被破壞了，即破壞了細(xì)胞的黏著，使得細(xì)胞與相鄰細(xì)胞失去黏著而導(dǎo)致程序性死亡。

2）核纖層蛋白：是位于細(xì)胞核內(nèi)膜下的一層纖維結(jié)構(gòu)，對(duì)內(nèi)膜具有支撐作用。核纖層蛋白被切割，導(dǎo)致核纖層解體、核被膜濃縮。

3）細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白：一些維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)必需的蛋白質(zhì)，如中間纖維、肌動(dòng)蛋白和凝膠溶解蛋白（gelsolin）等，被caspase切割后導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變。

4）與DNA修復(fù)相關(guān)的酶類：遭caspase切割后失活。由于DNA的修復(fù)是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要因素，這一因素遭到破壞，合成的DNA難以保證正確，因而導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。

5）caspase激活的DNase（CAD）抑制蛋白：caspase能夠?qū)AD抑制蛋白水解，導(dǎo)致這種酶被激活。該酶是一種內(nèi)切核酸酶，被激活后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與核DNA結(jié)合并將DNA切割成片段。

（3）細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)：細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控，在正常細(xì)胞caspase處于非活化的酶原狀態(tài)，凋亡程序一旦開始，caspase被激活，隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生不可逆的凋亡。細(xì)胞凋亡通過正負(fù)兩個(gè)方面進(jìn)行調(diào)控，即誘導(dǎo)因子和抑制因子參與的過程。誘導(dǎo)因素較多，前面已提及細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的啟動(dòng)信號(hào)，在此僅介紹部分抑制因子。

1）凋亡抑制分子：迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制分子，包括p35、CrmA、IAPs、FLIPs以及Bcl－2家族的凋亡抑制分子。桿狀病毒蛋白p35和牛痘病毒蛋白CrmA是廣譜凋亡抑制劑，體外研究結(jié)果表明p35以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合方式與靶分子形成穩(wěn)定的具有空間位阻效應(yīng)的復(fù)合體并且抑制caspases活性。Crm A（cytokine response modifier A）是血清蛋白酶抑制劑，能夠直接抑制多種蛋白酶的活性，但目前還未發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中存在p35和Crm A的同源分子。

FLIPs（FLICE－inhibitory proteins）能抑制Fas/TNFR－1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。它有多種變異體，但其N端功能前區(qū)（prodomain）完全相同，C端長(zhǎng)短不一。FLIPs通過DED功能區(qū)，與FADD和caspase－8和10結(jié)合，拮抗它們之間的相互作用，從而抑制caspase－8和10募集到死亡受體復(fù)合體以及死亡受體復(fù)合體的起始化。

凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein，IAPs）為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質(zhì)，首先從桿狀病毒基因組中克隆到，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制由病毒感染引起的宿主細(xì)胞死亡應(yīng)答。它們主要抑制caspase－3和caspase－7，但不結(jié)合它們的酶原；對(duì)caspase－8則既可以結(jié)合活化的caspase－8，又可結(jié)合caspase－8酶原，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。

2）Bcl－2家族：這一家族有眾多成員，目前已經(jīng)在哺乳動(dòng)物、線蟲和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)并鑒定出了Bcl－2家族的20余種蛋白質(zhì)，根據(jù)它們?cè)诩?xì)胞凋亡中的作用可分為兩類：一類是抗凋亡蛋白，包括Bcl－2、Bcl－xL、Bcl－w、Mcl－1、Al、Boo和Ced－9等10余個(gè)成員；另一類是促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bc－xS、Bid、Bad和Egl－1等10余個(gè)成員。多數(shù)成員間有兩個(gè)結(jié)構(gòu)同源區(qū)域，在介導(dǎo)成員之間的二聚體化過程中起重要作用。Bcl－2成員之間的二聚體化是成員之間功能實(shí)現(xiàn)或功能調(diào)節(jié)的重要形式。Bcl－2生理功能是阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，在一些白血病中Bcl－2呈過度表達(dá)。Bcl－2的亞細(xì)胞定位已經(jīng)明確，它在不同的細(xì)胞類型可以定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核膜上，并通過阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。此外，Bcl－2具有保護(hù)細(xì)胞的功能，Bcl－2的高表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱甘肽（GSH）的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低了caspase的活性。Bax是Bcl－2家族中參與促進(jìn)細(xì)胞凋亡的一個(gè)成員，具有對(duì)抗Bcl－2蛋白抑制凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)Bcl－2/Bax兩種蛋白之間的比例是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素。因此認(rèn)為，Bax是極重要的促細(xì)胞凋亡的因子之一，它可能是通過形成Bcl－2－Bax復(fù)合物或通過其他Bcl－2作用靶的競(jìng)爭(zhēng)來實(shí)現(xiàn)的。Bax與線粒體膜結(jié)合，釋放細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等。細(xì)胞色素C等與凋亡促進(jìn)因子－1（Apaf－1）和caspase－9結(jié)合形成復(fù)合物，激活CAD，造成基因組DNA裂解，并失活DNA修復(fù)相關(guān)酶（DNA－PK、PARA），造成DNA修復(fù)能力低下，分解細(xì)胞骨架等凋亡執(zhí)行過程。

總之，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)是非常復(fù)雜的，參與的分子也非常多，還有很多不為人們所知的機(jī)制需要進(jìn)一步的探索。

4.細(xì)胞凋亡與醫(yī)學(xué)　細(xì)胞凋亡之所以成為人們研究的一個(gè)熱點(diǎn)，在很大程度上決定于細(xì)胞凋亡與臨床疾病的密切關(guān)系。這種關(guān)系不僅表現(xiàn)在對(duì)凋亡及其機(jī)制的研究闡明了一大類免疫病的發(fā)病機(jī)制，而且由此可以導(dǎo)致疾病新療法的出現(xiàn)，特別是細(xì)胞凋亡與腫瘤及艾滋病之間的密切關(guān)系備受人們關(guān)注。

（1）HIV病毒感染造成CD4＋細(xì)胞減少是通過細(xì)胞凋亡機(jī)制：獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），簡(jiǎn)稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficienc virus，HIV）感染所致的以循環(huán)CD4^＋T細(xì)胞顯著下降、機(jī)會(huì)感染及惡性疾病為特征的繼發(fā)性免疫缺陷綜合征。AIDS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但病毒和宿主因素相互作用的復(fù)雜過程是其主要原因。AIDS的最主要的特征之一是CD4^＋T細(xì)胞的逐漸丟失。HIV通過合胞體依賴凋亡和HIV產(chǎn)物依賴凋亡殺死淋巴細(xì)胞。這一細(xì)胞凋亡機(jī)制不僅闡明了AIDS時(shí)CD4^＋T細(xì)胞減少的主要原因，同時(shí)也為AIDS的治療研究指明了一個(gè)重要的探索方向。

（2）從細(xì)胞凋亡角度看，腫瘤的發(fā)生是由于凋亡受阻所致：一般認(rèn)為惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞是因?yàn)槭Э厣L(zhǎng)、過度增殖，從細(xì)胞凋亡的角度看則認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制受到抑制，不能正常進(jìn)行細(xì)胞死亡清除的結(jié)果。腫瘤細(xì)胞中有一系列的癌基因和原癌基因被激活，并呈過表達(dá)狀態(tài)。這些基因的激活和腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間有著極為密切的關(guān)系。這些癌基因及其表達(dá)產(chǎn)物也是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，許多種類的癌基因表達(dá)以后，即阻斷了腫瘤細(xì)胞的凋亡過程，使腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加。較多資料表明在腫瘤發(fā)生中，Bcl－2、c－my和ras基因可協(xié)同轉(zhuǎn)化并使細(xì)胞永生化。另外，本屬程序性死亡的細(xì)胞如未按時(shí)凋亡，則這種“老化”細(xì)胞的染色體會(huì)不穩(wěn)定，基因易突變，對(duì)致癌物的易感性升高，從而增加了惡變概率。抑癌基因p53的缺失使細(xì)胞凋亡大大減少，自發(fā)腫瘤發(fā)生率上升。因此，腫瘤不僅是細(xì)胞增殖和分化異常的疾病，也是細(xì)胞凋亡的疾病。細(xì)胞凋亡異常與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等許多生物學(xué)行為密切相關(guān)。因此，通過細(xì)胞凋亡機(jī)制來設(shè)計(jì)對(duì)腫瘤的治療方法就是重建腫瘤細(xì)胞的凋亡信號(hào)傳遞系統(tǒng)，即激活死亡基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生存基因的表達(dá)。

（3）細(xì)胞凋亡與自身免疫?。鹤陨砻庖卟“ㄒ淮箢愲y治性的免疫紊亂而造成的疾病，自身反應(yīng)性T細(xì)胞及產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞是引起自身免疫病的主要免疫病理機(jī)制細(xì)胞。正常情況下，免疫細(xì)胞的活化是一個(gè)極為復(fù)雜的過程。在自身抗原的刺激作用下，識(shí)別自身抗原的免疫細(xì)胞被活化，從而通過細(xì)胞凋亡的機(jī)制得到清除。但如這一機(jī)制發(fā)生障礙，那么識(shí)別自身抗原的免疫活性細(xì)胞的清除就會(huì)產(chǎn)生障礙。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見的典型自身免疫性疾病，以自身抗體產(chǎn)生和免疫復(fù)合物形成特征，可引起多器官損害。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者外周血淋巴細(xì)胞凋亡水平異常可引起機(jī)體內(nèi)多種自身抗體產(chǎn)生，形成免疫復(fù)合物沉積，因此推斷細(xì)胞凋亡可參與SLE的發(fā)病機(jī)制。在IPr或gld小鼠中，F(xiàn)as和FasL分別發(fā)生了基因突變。這些小鼠由于細(xì)胞凋亡減少而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞聚集，臨床表現(xiàn)類似SLE。

（4）神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變：神經(jīng)退行性疾病是一類嚴(yán)重影響人類健康的常見病，有肌萎縮性側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateralsclerosis，ALS）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD），帕金森?。≒arkinson disease，PD），亨廷頓病（Hunt－ington disease，HD）等。AD是一種不可逆的退行性神經(jīng)疾病，來自淀粉樣前體蛋白（APP）的β淀粉樣蛋白（amyloid proteinβ，Aβ）、早老蛋白－1（PS1）、早老蛋白－2（PS2）的突變導(dǎo)致家族性阿爾茨海默?。‵AD）。Aβ毒性作用的基本特征是神經(jīng)元凋亡。研究結(jié)果表明，Aβ是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。早老蛋白也參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，PS1、PS2的過表達(dá)能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性。Bcl－2基因家族兩個(gè)成員Bcl－xl和Bcl－2參與了對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。

（5）細(xì)胞凋亡與動(dòng)脈粥樣硬化（AS）：近年研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡在AS的發(fā)病中可能起著重要作用。通過凋亡檢測(cè)方法——末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP生物素?cái)喽藰?biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)人AS冠狀動(dòng)脈和頸動(dòng)脈，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病變內(nèi)膜中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于無病變的內(nèi)膜，AS斑塊中可檢出凋亡寡核苷酸片段，表明AS病變中有細(xì)胞凋亡發(fā)生。動(dòng)物試驗(yàn)也證明AS斑塊中有細(xì)胞凋亡發(fā)生。其中發(fā)生凋亡的細(xì)胞多數(shù)是平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。平滑肌細(xì)胞凋亡失調(diào)和凋亡小體清除不足可能是加劇AS發(fā)展的重要因素。

（潘鑾鳳）

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