第七節(jié)　基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測

隨著基因工程技術(shù)的日趨成熟，基因表達(dá)產(chǎn)物的種類越來越多。根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)用對象的不同，相應(yīng)的分析、鑒定和純化方法也有不同的要求。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)本身就是一種優(yōu)良的抗原或半抗原，因此目前常用免疫學(xué)技術(shù)測定可溶性蛋白質(zhì)。

經(jīng)各種方法獲得蛋白后，可用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）以及一些免疫學(xué)方法如Western印跡、ELISA、固相放射免疫測定、免疫沉淀反應(yīng)、放射免疫沉淀法及免疫熒光抗體技術(shù)等檢測宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白，也可直接檢測表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性。應(yīng)強調(diào)的是，進行SDS－PAGE及Western印跡所測樣品并非一定是可溶性蛋白質(zhì)，也可以是細(xì)胞培養(yǎng)液離心后所得的細(xì)胞沉淀，而用其他免疫學(xué)方法測定蛋白質(zhì)一般要求樣品為可溶性。

一、聚丙烯酰胺凝膠電泳

PAGE分離蛋白質(zhì)的原理是以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)體系（即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性），使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶，然后再進行電泳分離。

在蛋白質(zhì)溶液中加入SDS和還原劑（如DTT、β^－ME）后，還原劑使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，SDS把蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物，在足夠量的SDS作用下，使各種蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子本身的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。這樣的蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率只與蛋白質(zhì)分子的大小相關(guān)，因而可根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，來篩選陽性表達(dá)的重組體。陽性表達(dá)的重組體應(yīng)出現(xiàn)一條與預(yù)計目的蛋白的相對分子質(zhì)量相同的蛋白帶，而對照空載體沒有。這種方法在目的蛋白表達(dá)水平較高時可采用。目的蛋白表達(dá)水平較低時，有可能看不到陽性蛋白條帶，此時應(yīng)用其他更特異的方法檢測，如Western印跡分析、ELISA等。

二、Western印跡分析

Western印跡分析是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到化學(xué)合成膜的支撐物上，然后以特定的親和反應(yīng)、免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)以及顯色系統(tǒng)分析此印跡。其過程大致為：經(jīng)SDS－PAGE后的樣品轉(zhuǎn)移并固定在硝酸纖維素膜等固相膜上，然后將印有蛋白條帶的膜依次與針對目的蛋白的特異抗體、酶標(biāo)記第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使蛋白條帶染色。Western印跡檢測蛋白質(zhì)特異性和敏感性高，可檢測出納克水平的蛋白質(zhì)，因而在實驗室中廣泛采用。

三、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

ELISA是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫技術(shù)。利用抗原或抗體可以和酶結(jié)合，所形成的復(fù)合物既保留了免疫學(xué)活性，又保留了酶活性這一特點，把待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。洗滌后，加入酶反應(yīng)的底物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析。該法既可用于測定抗原，也可用于測定抗體，可檢測出低至納克水平的蛋白質(zhì)。ELISA既具有抗原抗體反應(yīng)的特異性，又有酶促反應(yīng)的生物放大作用，因此可作為基因表達(dá)產(chǎn)物的定性、定量測定方法。該法可分為直接法、間接法、夾心法和競爭法。

四、固相放射免疫測定

固相放射免疫測定的原理基本上與ELISA相同，主要區(qū)別在于用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，目前常用的放射性核素是125I。各種類型的ELISA測定方法同樣適用于固相放射免疫測定，但固相放射免疫測定的敏感度高于ELISA，可檢出低于1pg的目的蛋白。因此，對于分析極微量的蛋白質(zhì)十分有用。

五、免疫沉淀反應(yīng)

免疫沉淀反應(yīng)是在可溶性抗原與特異抗體結(jié)合的基礎(chǔ)上建立的，實驗室中常用到的是凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng)，即利用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬煽梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。這種方法可檢測出每毫升中微克水平的蛋白質(zhì)。根據(jù)抗原和抗體反應(yīng)的方式，分為單向擴散試驗和雙向擴散試驗。

六、放射免疫沉淀法

是依據(jù)抗原抗體發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)建立的。其顯著特點是用放射性核素標(biāo)記表達(dá)產(chǎn)物，因而使檢測的靈敏度大大提高，可檢出低至100pg的蛋白質(zhì)，應(yīng)用于蛋白質(zhì)混合物中目的蛋白的定性與定量，對于表達(dá)水平較低的蛋白質(zhì)的檢出尤為適用。

七、表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性檢測

不同蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性不盡相同，應(yīng)根據(jù)具體蛋白進行測定。如IL－2能促使T細(xì)胞的生長和增殖，可用IL－2依賴的CTL細(xì)胞檢測IL－2的活性。又如干擾素能刺激某些指示細(xì)胞（如人羊膜上皮細(xì)胞Wish株、人喉癌細(xì)胞株Hep－2等）產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而使細(xì)胞免受某些病毒的攻擊，可根據(jù)待測樣品不同稀釋度的保護能力，計算出干擾素生物學(xué)活性單位。

（王松梅）

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