三、改良二苯胺法

（一）實(shí)驗(yàn)原理

同二苯胺法。用乙酸戊酯把反應(yīng)中形成的藍(lán)色產(chǎn)物抽提到有機(jī)溶劑相進(jìn)行濃縮，靈敏度有所提高。

所得反應(yīng)的產(chǎn)物同樣在595nm有最大吸收值。待測(cè)樣品濃度在10～70μg/mL DNA范圍內(nèi)吸光度與DNA的濃度成線性關(guān)系。

（二）實(shí)驗(yàn)藥品

1．4％二苯胺冰醋酸溶液：4g二苯胺加少量冰醋酸加熱溶解后，加冰醋酸至100mL，當(dāng)天使用；

2．20％過氯酸：71.4mL 70％過氯酸（A.R.）加水至250mL；

3．DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液：配成100μg/mL。注意DNA在水內(nèi)較難溶，需隔夜配制；

4．乙酸戊酯（C.P.）。

（三）實(shí)驗(yàn)方法

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取100μg/mL DNA的標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL至各個(gè)測(cè)定管中，每管加水至2mL，再加2mL 20％過氯酸，4mL4％二苯胺，充分搖勻，在56℃下保溫1h，流動(dòng)水冷卻，每管加2mL乙酸戊酯，劇烈搖動(dòng)混勻，靜止放置5～10min或經(jīng)3000r/min離心1min，使混合液分成有機(jī)相和水相兩層，在波長595nm下測(cè)定有機(jī)相的吸光度（用0.5cm比色皿）。以吸光度為縱坐標(biāo)、DNA量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．樣品中DNA含量的測(cè)定

樣品用水配成20～60μg/mL濃度，吸取2mL加2mL20％過氯酸，4mL4％二苯胺，充分搖勻，以后同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟一樣操作，空白以水代DNA，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品中DNA量，再根據(jù)稀釋倍數(shù)算出樣品中DNA含量。

（四）實(shí)驗(yàn)記錄

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2．實(shí)驗(yàn)記錄