酸奶發(fā)酵技術(shù)_生物工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)指

綜合實(shí)驗(yàn)七　酸奶發(fā)酵技術(shù)

一、背景知識(shí)

（一）酸奶簡(jiǎn)介

酸奶（Yogurt）是以牛奶為主要原料，利用保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等微生物，通過乳酸發(fā)酵作用而得到的一種發(fā)酵型乳制品，其中含有大量的活性乳酸菌。酸奶的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值頗高，可增強(qiáng)腸胃的消化功能，促進(jìn)人體對(duì)鈣和磷的有效利用，增加腸道有益菌的數(shù)量，降低血清中膽固醇含量，預(yù)防心血管疾病和抗癌活性。酸奶還可以為乳糖不耐癥人群提供消費(fèi)牛奶的機(jī)會(huì)。

我國(guó)從20世紀(jì)80年代初才開始商業(yè)化生產(chǎn)酸奶，雖然起步較晚，但我國(guó)的酸奶工業(yè)發(fā)展迅速，目前在大中城市及農(nóng)村，酸奶的消費(fèi)已相當(dāng)普遍，是我國(guó)液態(tài)奶中發(fā)展最快的乳制品之一。酸奶主要分為普通型酸奶、功能型酸奶和風(fēng)味型酸奶。普通型酸奶在發(fā)酵過程中除加入糖外，不再添加任何成分，以保持酸奶的清香味。風(fēng)味酸奶分為凝固型和攪拌型兩種：凝固型風(fēng)味酸奶是在原料奶中預(yù)先添加風(fēng)味物質(zhì)，如花生乳、綠豆?jié){、松仁、玉米乳等，經(jīng)巴氏殺菌后發(fā)酵而成；攪拌型風(fēng)味酸奶是在乳酸菌發(fā)酵原料奶凝固之后，再加入風(fēng)味物質(zhì)，如蜂蜜、果醬、果肉、果菜、胡蘿卜汁、枸杞子、香料等調(diào)制而成。如果添加的天然風(fēng)味物質(zhì)具有保健功能，此類酸奶也可稱為保健型酸奶或功能型酸奶。

（二）酸奶風(fēng)味的來源

相比于原料奶，酸奶具有獨(dú)特的風(fēng)味和口感，不同類型酸奶中的風(fēng)味物質(zhì)的成分及含量因加工工藝和方法的不同而各有特色。酸奶中的風(fēng)味物質(zhì)主要來源于原料奶中的組成成分、微生物代謝產(chǎn)物及添加的風(fēng)味物質(zhì)。新鮮的牛乳（原料乳）有一股淡淡的奶香味，已確定的香味成分主要有丙酮、乙酸、油酸及其他的游離脂肪酸和揮發(fā)性的二甲硫醚等。發(fā)酵過程中標(biāo)準(zhǔn)化、均質(zhì)、加熱、殺菌等流程均可引起乳制品風(fēng)味的變化。鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus thermophilus S.t）和德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus L.b）產(chǎn)生的乳酸及各種揮發(fā)性的有機(jī)香氣物質(zhì)賦予酸奶典型風(fēng)味（Mounchili，2005）。酸奶的風(fēng)味由揮發(fā)性和非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同組成，揮發(fā)性的成分起主要的作用，揮發(fā)性成分的濃度決定了最終風(fēng)味的組成。篩選發(fā)酵劑主要測(cè)定二丁酮、雙乙酰、乙醇、乙酵、丙酮等作為風(fēng)味的標(biāo)志性物質(zhì)，可釆用化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合感官評(píng)價(jià)的方法對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析和研究，既能對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析，又可防止測(cè)定結(jié)果對(duì)感官評(píng)價(jià)的偏離。酸奶風(fēng)味的散發(fā)不僅與風(fēng)味的分布及濃度有關(guān)，還與溫度、攪拌參數(shù)及脂肪含量相關(guān)。

二、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介

本實(shí)驗(yàn)分為兩部分，第一部分為酸奶的制作工藝，第二部分為酸奶中乳酸菌種類與含量分析，涵蓋了目前市場(chǎng)上以牛奶為原料乳的酸奶的主要生產(chǎn)工藝技術(shù)，通過這兩部分內(nèi)容的學(xué)習(xí)和實(shí)踐，可為今后從事酸奶的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)7-1　酸奶的制作

（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握酸奶的制作原理。

2.學(xué)會(huì)酸奶的制作方法。

（二）實(shí)驗(yàn)原理

酸奶具有清新爽口的味覺，倍受廣大消費(fèi)者歡迎。酸奶中含有乳酸菌的菌體及代謝產(chǎn)物，對(duì)腸道內(nèi)的致病菌有一定的壓抑作用，對(duì)人體的腸道消化道疾病有良好的治療效果。

酸奶是以牛乳為主要原料，接入一定量的乳酸菌，經(jīng)發(fā)酵后而制成的一種乳制品，當(dāng)乳酸菌在牛乳中生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酸至一定程度時(shí)，pH下降，使乳酪蛋白在其等電點(diǎn)附近發(fā)生凝集而呈凝乳狀，這種凝乳狀酸奶稱為凝固型酸奶。

（三）主要材料及設(shè)備

鮮牛奶、奶粉、蔗糖、菌種（或市售酸奶）、天平、燒杯、玻璃棒、牛奶瓶、恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、不銹鋼鍋。

（四）實(shí)驗(yàn)方法

1.凝固型酸奶制作

在原料乳中添加發(fā)酵劑后立即進(jìn)行包裝，并在包裝容器中發(fā)酵而成，成品呈凝乳狀。

（1）工藝流程

（2）操作步驟

①牛奶瓶消毒。

將牛奶瓶在不銹鋼鍋里用沸水煮15min。

②牛乳的凈化。

利用特別設(shè)計(jì)的離心機(jī)，除去牛乳中的白血球和其他肉眼可見的異物。

③脂肪含量標(biāo)準(zhǔn)化。

鮮奶中脂肪含量比較高，為了避免酸奶中有脂肪析出，需要對(duì)鮮奶的脂肪含量進(jìn)行調(diào)整使其達(dá)到所要求的標(biāo)準(zhǔn)?？梢栽谥竞扛叩呐Ｈ橹屑尤胍欢康拿撝?，或通過分離機(jī)從牛乳中分離出稀奶油，然后在得到的脫脂乳中再摻入一定量稀奶油，使調(diào)制乳的脂肪含量達(dá)到要求。

④配料。

奶粉的添加。經(jīng)脂肪含量標(biāo)準(zhǔn)化處理的調(diào)制乳（或按1∶7的比例加水把奶粉配制成復(fù)原牛奶），為了使其非脂干物質(zhì)含量達(dá)到要求，一般往調(diào)制乳中添加脫脂奶粉，經(jīng)如此處理的酸奶有一定的硬度，脫脂奶粉的添加量一般為1%～3%。

蔗糖的添加。為了緩和酸奶的酸味，改善酸奶的口味，一般在調(diào)制乳中加入4%～8%的蔗糖。如果蔗糖量加入過多，會(huì)因調(diào)制乳滲透壓的增加而阻礙乳酸菌生長(zhǎng)。一般是先將原料乳加熱到60℃左右，然后加入蔗糖，待糖溶解后，過濾除雜，過濾的奶液再進(jìn)行均質(zhì)處理。

⑤均質(zhì)。

用于制作酸奶的原料乳一般都要進(jìn)行均質(zhì)處理。經(jīng)過均質(zhì)處理，乳脂肪被充分分散，酸奶不會(huì)發(fā)生脂肪上浮現(xiàn)象，酸奶的硬度和黏度都有所提高，而且酸奶口感細(xì)膩，更易被消化吸收。將加熱和均質(zhì)兩種方法適當(dāng)結(jié)合起來處理的效果會(huì)更好。一般是先將原料乳調(diào)至60℃左右，然后在均質(zhì)機(jī)中，于8～10MPa壓力對(duì)乳進(jìn)行均質(zhì)處理。

⑥滅菌。

均質(zhì)后的原料乳的滅菌方法大致有兩種：將乳加熱至90℃，保溫5min，或置于80℃恒溫水浴鍋中滅菌15min；也可用超高溫瞬時(shí)滅菌法（在135℃下保溫2～3s）。

滅菌目的：殺滅原料乳中的微生物，特別是致病菌；形成乳酸菌生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)，破壞乳中存在的阻礙乳酸菌生長(zhǎng)的物質(zhì)；除去原料乳中的氧及由于乳清蛋白的變性而增加的-SH，從而使氧化還原電位下降，有助乳酸菌的生長(zhǎng)；使乳清蛋白變性膨潤(rùn)，從而改善酸奶的硬度和黏度，并阻止水分從變性脂蛋白凝聚成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中分離出來；滅菌后，使乳中原本存在的酶失活，使發(fā)酵過程成為單一乳酸菌的作用過程，易于控制生產(chǎn)；經(jīng)滅菌處理后的原料乳迅速冷卻到43～45℃待接種。

⑦接種。

在43～45℃滅過菌的原料乳中加入發(fā)酵劑，接種量為2%～3%，通常是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合菌，兩種菌的比例為1∶1或2∶1。球菌的接種量稍多些，可彌補(bǔ)由于桿菌生長(zhǎng)產(chǎn)酸而阻礙球菌生長(zhǎng)所造成的球菌數(shù)量不足的缺點(diǎn)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)接種量超3%時(shí)，發(fā)酵所需時(shí)間并不因種量加大而縮短，而酸奶的風(fēng)味由于發(fā)酵前期酸度上升太快反而變差。所以，任意加大接種量是無益的，反之，若接種量過小，發(fā)酵所需時(shí)間延長(zhǎng)，酸奶的酸味會(huì)顯得不夠。

⑧分裝。

酸奶受到振動(dòng)，凝乳狀態(tài)易被破壞，因此，不能在發(fā)酵罐中先發(fā)酵然后再進(jìn)行分裝。分裝必須是將含有乳酸菌的牛乳培養(yǎng)基先分裝到銷售用的玻璃瓶或塑料小容器中，加蓋后送入恒溫室培養(yǎng)，在容器中發(fā)酵制成酸奶，為了避免雜菌的侵入，分裝操作應(yīng)在無菌室中進(jìn)行。牛乳分裝后，容器上部留出的空隙要盡可能小，這樣容器中的內(nèi)容物晃動(dòng)幅度小，酸奶的形態(tài)易保持完整。另外，減少空氣也有利于乳酸菌的生長(zhǎng)。整個(gè)分裝操作的時(shí)間要短，使乳液溫度下降少，這樣乳液溫度與所設(shè)定的發(fā)酵溫度接近，整個(gè)發(fā)酵時(shí)間就不會(huì)被延長(zhǎng)。

⑨發(fā)酵。

將裝有含乳酸菌的牛乳的容器置于恒溫箱中進(jìn)行發(fā)酵，恒溫箱的溫度保持在40～43℃，時(shí)間為3～4h；或30℃培養(yǎng)18～20h。

發(fā)酵終點(diǎn)的確定有兩種方法：發(fā)酵奶的酸度已達(dá)到65～70oT［用0.1mo L/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定10mL樣品，每消耗掉1mLNaOH溶液稱為1滴定酸度（oT）］，或pH＝4～5；發(fā)酵奶的流動(dòng)性變差，基本凝固。

⑩冷卻。

發(fā)酵結(jié)束，在將酸奶移放進(jìn)冷藏室進(jìn)行貯存和后熟處理之前，應(yīng)將酸奶從發(fā)酵室中取出，用冷風(fēng)迅速將其冷卻到10℃以下，使酸奶中的乳酸菌停止生長(zhǎng)，防止酸奶酸度過高而影響口感。

后熟。

酸奶在形成凝塊后應(yīng)在4～7℃下保持24h以上，以獲得酸奶特有風(fēng)味和較好口感。

冷藏。

經(jīng)冷卻處理的酸奶貯藏在2～5℃，最好是-1～0℃的冷藏室保存。

低溫保存有以下優(yōu)點(diǎn)：保存期間酸奶的酸度上升極少；牛乳凝固時(shí)會(huì)產(chǎn)生收縮力，導(dǎo)致乳清析出，在低溫時(shí)這種收縮力比較弱，所以乳清不易從酸奶中分離出來；低溫下酸奶逐漸形成白玉般的組織狀態(tài)，結(jié)構(gòu)非常細(xì)膩；低溫保存過程中，香味物質(zhì)逐漸形成，使酸奶具有較濃香味。

品味。

酸奶應(yīng)有凝塊，質(zhì)地細(xì)膩、酸甜適中、清新爽口，若有不良異味，則很可能是酸奶污染了雜菌。

（五）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

選擇優(yōu)質(zhì)、新鮮的牛奶和酸奶（作為菌種）。

嚴(yán)格無菌操作，盡量避免雜菌污染。

酸奶制好后，應(yīng)在0～5℃下保藏，保質(zhì)期為5d。

附：原料奶質(zhì)量要求

1.來源于健康牛所產(chǎn)的乳，色澤呈乳白色或微黃色，氣味芳香、無異味。初乳、末乳、細(xì)菌污染乳均不得使用。

2.乳牛注射抗生素后所產(chǎn)出乳，4d內(nèi)不得使用。生產(chǎn)前應(yīng)做小樣試驗(yàn)。

3.總?cè)楣腆w不低于11.5%，非脂乳固體大于8.5%。

4.原料中不得含堿及菌劑等雜質(zhì)。

5.奶溫不高于10℃，70度酒精試驗(yàn)無絮狀物沉淀。

酸奶衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

1.感官指標(biāo)

呈乳白色或稍帶淡黃色，具有清香純凈的乳酸味，凝塊稠密、結(jié)實(shí)、均勻，無氣泡，允許少量乳清析出。

2.理化指標(biāo)

3.細(xì)菌指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)7-2　酸奶中乳酸菌種類與含量分析

益生菌是一種通過改善腸道微生物平衡，從而對(duì)宿主施加有益作用的微生物，它們對(duì)人體機(jī)體有其他多種菌群無法起到的生理調(diào)節(jié)作用。其主要功效有：調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，防止便秘，幫助消化；改善和提高自然免疫功能（抑制癌癥細(xì)胞）；抗過敏；處理乳糖不耐癥；供應(yīng)人體健康所必需的氨基酸及維生素B；抑制致癌物質(zhì)及其他有害微生物的形成；促進(jìn)體內(nèi)有益菌的生長(zhǎng)；降低血脂和高血壓；延緩老化。在我國(guó)市場(chǎng)上生產(chǎn)銷售的各種酸奶制品中，作為益生菌添加的乳酸菌，通常為保加利亞乳桿菌和嗜熱乳酸鏈球菌，近年來雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌等也被廣泛使用。乳酸菌活菌體需達(dá)到一定數(shù)量，才有可能到達(dá)并定植在人體腸道內(nèi)，抑制有害菌的增殖和活動(dòng)，維持腸道的微生態(tài)平衡，增進(jìn)人體的健康。對(duì)這類產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)時(shí)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，即用乳酸菌數(shù)量來評(píng)價(jià)活性乳酸菌制品的質(zhì)量顯得尤為重要。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 19302-2010）對(duì)發(fā)酵乳亦做出相關(guān)規(guī)定，乳酸菌數(shù)不得低于1×106CFU/mL?？梢?，酸奶中乳酸菌數(shù)量已正式成為評(píng)價(jià)酸奶質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

目前市場(chǎng)上銷售的酵奶制品，主要是由雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌等菌群共同發(fā)酵而成的，酸度與風(fēng)味和質(zhì)量變化是息息相關(guān)的。

由于乳酸菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)有復(fù)雜的要求，生長(zhǎng)需要碳水化合物、氨基酸、肽類、脂肪酸、酯類、核酸衍生物、維生素和礦物質(zhì)等，一般的肉湯培養(yǎng)基難以滿足其要求。測(cè)定乳酸菌時(shí)必須盡量將試樣中所有活的乳酸菌檢測(cè)出來。要提高檢出率，關(guān)鍵是選用特定良好的培養(yǎng)基。采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法，檢測(cè)酸奶中的各種乳酸菌可獲得滿意的結(jié)果。

（一）試劑材料

1.培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基和MC培養(yǎng)基。

2.主要試劑

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、mgSO4· 7H2O、MnSO4·4H2O、吐溫-80、瓊脂粉、氯化鈉、革蘭氏染色液、甲基紅試劑、3%過氧化氫、吲哚試劑、固體石蠟、氫氧化鈉等。

3.儀器和器具

無菌移液管（25mL，1mL），無菌水（225mL帶玻璃珠三角瓶，9mL試管），無菌培養(yǎng)皿，旋渦均勻器，恒溫培養(yǎng)箱。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.酸奶中不同益生菌的分離、鑒定

將酸奶畫線接種于MRS瓊脂平板和MC瓊脂平板中，37℃下厭氧培養(yǎng)。48h后挑取不同特征的代表性菌落，革蘭氏染色鏡檢，觀察染色反應(yīng)及形態(tài)特征。對(duì)兩種培養(yǎng)基中不同特征的菌落接種與乳酸菌微量生化管，24～48h內(nèi)觀察生化反應(yīng)結(jié)果。根據(jù)形態(tài)、染色結(jié)果及生化反應(yīng)結(jié)果判定益生菌的類型。

2.活性乳酸菌菌落計(jì)數(shù)

參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)　雙歧桿菌的鑒定》（GB4789.34—2012，見附錄4）和《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)　乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35—2010，見附錄5）的方法進(jìn)行檢測(cè)。

將酸奶用無菌生理鹽水稀釋成不同梯度，取1mL傾注平板法接種于MRS瓊脂平板和MC瓊脂平板中，37℃下厭氧培養(yǎng)48h，實(shí)驗(yàn)取3個(gè)連續(xù)濃度，3個(gè)平行，以加1mL無菌生理鹽水為空白對(duì)照。根據(jù)表1-7-1的結(jié)果，對(duì)不同益生菌種類進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3.酸奶的pH值及酸度測(cè)定

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《乳與乳制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》（GB/T 5009.46—2003）。

用211型pH計(jì)直接測(cè)定待測(cè)酸奶的pH值，用標(biāo)定后的0.1mol/L的NaOH溶液滴定，測(cè)定出酸奶的酸度值，酸度（°T）度數(shù)是以酚酞作指示劑，中和100mL酸奶所需氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.1mol/L）的毫升數(shù)。

吸取10mL酸奶，置于250mL的三角瓶中，加入20mL水，再加入0.5mL的0.5%酚酞乙醇溶液，小心搖勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到微紅色，在1min內(nèi)不消失為測(cè)定終點(diǎn)（終點(diǎn)用0.005%堿性品紅溶液作對(duì)照）。

式中：VNaOH—消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，mL；

　　　V1—空白溶液消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，mL；

　　　cNaOH—標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L。

（三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.乳酸菌分離結(jié)果

表1-7-1　酸奶中乳酸菌的菌落特征及菌體形態(tài)

2.生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將表1-7-1中的不同菌落分別接種不同的微量生化管，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1-7-2　生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.不同工藝酸奶的口感、酸度等結(jié)果

分析接種量、培養(yǎng)時(shí)間、加糖量對(duì)酸奶口感、酸度、風(fēng)味和品質(zhì)的影響

（四）討論

1.綜合評(píng)價(jià)制作酸奶的品質(zhì)，說說你的體會(huì)。

2.分離和鑒定酸奶乳酸菌過程中的注意事項(xiàng)。

參考文獻(xiàn)

［1］Mounchili A，Wichtel J J，Bosset J O，et al.HS-SPME gas chromatographic characterization of volatile［J］.International Dairy Journal，2005（12）.

（編者：高永生）