血清總膽紅素及其組分的測(cè)定分為重氮鹽法、膽紅素氧化酶法(BOD)、高效液相色譜法(HPLC)、導(dǎo)數(shù)分光光度法及直接分光光度法5種。本節(jié)介紹重氮試劑改良J-G法和膽紅素氧化酶法。

(一)改良J-G法測(cè)定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素

【原理】 血清中結(jié)合膽紅素可直接與重氮試劑反應(yīng),產(chǎn)生偶氮膽紅素;非結(jié)合膽紅素在加速劑咖啡因-苯甲酸鈉-醋酸鈉作用下,其分子內(nèi)氫鍵破壞后才能與重氮試劑反應(yīng),也產(chǎn)生偶氮膽紅素。本法重氮反應(yīng)p H6.5,最后加入堿性酒石酸鈉使紅色偶氮膽紅素轉(zhuǎn)變成藍(lán)色偶氮膽紅素。在600nm波長(zhǎng)比色,其吸光度與膽紅素濃度成正比。

【器材與試劑】

1.器材 試管、試管架、加樣器、恒溫水浴箱、分光光度計(jì)、鉛筆、坐標(biāo)紙。

2.試劑

(1)咖啡因-苯甲酸鈉試劑:無(wú)水醋酸鈉56g,苯甲酸鈉56g,EDTA-Na2 1g,溶于約700ml水中,再加入咖啡因37.5g,攪拌至完全溶解(加入咖啡因后不能加熱溶解),再加水至1L。試劑可能有輕微渾濁,用定量濾紙過(guò)濾,室溫保存。

(2)5g/L亞硝酸鈉溶液:稱取亞硝酸鈉0.5g,溶于約70ml蒸餾水中,再加蒸餾水至100ml。每2周配1次。儲(chǔ)存于4℃冰箱。

(3)5g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液:對(duì)氨基苯磺酸5g溶于約800ml去離子水中,加濃鹽酸15ml,待完全溶解后,再加去離子水至1000ml,室溫保存。

(4)重氮試劑:臨用前,取上述亞硝酸鈉溶液0.5ml與對(duì)氨基苯磺酸溶液20ml混勻。

(5)5g/L疊氮鈉溶液:疊氮鈉0.5g,用去離子水溶解并稀釋至100ml。

(6)堿性酒石酸鈉溶液:氫氧化鈉75.0g與酒石酸鉀鈉(Na KC4 H 4 O 6·4 H 2 O)320g溶于約700ml蒸餾水中,再加水至1L。如果渾濁,過(guò)濾,室溫保存。

(7)膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液:

①目前一般用游離(非結(jié)合)膽紅素配制標(biāo)準(zhǔn)液:此標(biāo)準(zhǔn)品須用含清蛋白的溶劑配制,用人血清代替,收集無(wú)溶血、無(wú)黃疸、清晰的血清作為混合血清稀釋劑?；旌涎逑♂寗?yīng)符合下列要求:混合血清1.0ml,加入新鮮0.154mmol/L NaCl溶液24ml,混勻。在414nm波長(zhǎng),光徑1.0cm,以0.154mmol/L NaCl溶液調(diào)零,其吸光度應(yīng)<0.100,在460nm波長(zhǎng)的吸光度應(yīng)<0.040。

②配制標(biāo)準(zhǔn)液的膽紅素須符合下列標(biāo)準(zhǔn):純膽紅素的氯仿溶液,在25℃條件下,光徑(1.000±0.001)cm,波長(zhǎng)453nm,摩爾吸光系數(shù)應(yīng)在60 700±1600范圍內(nèi);改良J-G法偶氮膽紅素的摩爾吸光系數(shù)應(yīng)為74 380±866。

③膽紅素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液(1712μmol/L):稱取符合要求的純膽紅素(相對(duì)分子量584 068) 10.0mg,加二甲亞砜1ml,用玻璃棒攪拌成混懸液。加入0.05mol/L碳酸鈉溶液2ml,使膽紅素完全溶解,移入100ml容量瓶,以稀釋用血清洗滌數(shù)次后并入容量瓶中,緩慢加入0.1mol/L鹽酸2ml,邊加邊搖(切勿用力搖動(dòng),以免產(chǎn)生氣泡)。最后以稀釋用血清定容。配制過(guò)程中應(yīng)盡量避光,貯存容器用黑紙包裹,置4℃冰箱3d內(nèi)有效,要求配制后盡快繪制矯正曲線。

【操作】

1.樣品的測(cè)定 按表9-6進(jìn)行操作。

表9-6　改良J-G法測(cè)定總膽紅素和結(jié)合膽紅素操作步驟

混勻后,對(duì)照管調(diào)零,600nm波長(zhǎng),讀取各管吸光度,從矯正曲線上查出總膽紅素和結(jié)合膽紅素濃度。

2.膽紅素矯正曲線的繪制 按表9-7稀釋膽紅素儲(chǔ)存液。

表9-7　膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液的配制

將以上各管充分混勻(不可產(chǎn)生氣泡),按照血清總膽紅素方法進(jìn)行操作。每一濃度做3個(gè)平行管。每一濃度分別做標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管,以各自的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管調(diào)零,讀取各標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度。配制標(biāo)準(zhǔn)液用的試劑血清中尚含有少量膽紅素,同樣測(cè)定后有一吸光度值。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值均應(yīng)減去此吸光度,而后與相應(yīng)膽紅素濃度繪制矯正曲線。

【參考區(qū)間】 血清總膽紅素:3.4~17.12μmol/L;血清結(jié)合膽紅素:0~3.42μmol/L。

【質(zhì)量保證】

1.膽紅素對(duì)光敏感,標(biāo)準(zhǔn)液及標(biāo)本應(yīng)盡量避光保存。膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品需妥善保存,正確配制。

2.輕度溶血對(duì)本法無(wú)影響,嚴(yán)重溶血可使測(cè)定結(jié)果偏低。

3.疊氮鈉能破壞重氮試劑,終止偶氮反應(yīng)。因此用疊氮鈉作防腐劑的質(zhì)控血清,可引起偶氮反應(yīng)不完全,甚至不呈色。

4.膽紅素342μmol/L的標(biāo)本可減少標(biāo)本用量,或用0.154mmol/L NaCl溶液稀釋血清后重新測(cè)定。

5.本法測(cè)定血清總膽紅素,在10~37℃條件下不受溫度的影響,呈色2h內(nèi)非常穩(wěn)定。

6.標(biāo)本對(duì)照管的吸光度一般很接近,若遇標(biāo)本量很少時(shí),可不做標(biāo)本對(duì)照管,參照其他標(biāo)本對(duì)照管的吸光度。

【應(yīng)用評(píng)價(jià)】 結(jié)合膽紅素測(cè)定在臨床上應(yīng)用很廣,但至今無(wú)候選參考方法。方法不同,反應(yīng)時(shí)間不同,結(jié)果差異很大。時(shí)間短,非結(jié)合膽紅素參與反應(yīng)少,但結(jié)合膽紅素反應(yīng)也不完全;時(shí)間長(zhǎng),結(jié)合膽紅素反應(yīng)較完全,但一部分非結(jié)合膽紅素也參與反應(yīng)。本法為推薦的常規(guī)方法,線性范圍較寬,濃度在342μmol/L以下有較好的準(zhǔn)確度和精密度,高濃度時(shí)準(zhǔn)確度和精密度降低。因此,建議濃度過(guò)高應(yīng)減少標(biāo)本用量測(cè)定。在重氮試劑方法中,改良J-G法有好的靈敏度,抗干擾能力較好。血紅蛋白低于1.0g/L無(wú)干擾。缺點(diǎn)是不能自動(dòng)化分析。

【臨床意義】

1.血清總膽紅素 ①黃疸及黃疸程度的鑒別:溶血性、肝細(xì)胞性及阻塞性黃疸引起血清膽紅素依次升高。②肝細(xì)胞損害程度和預(yù)后的判斷:膽紅素明顯升高反映有嚴(yán)重的肝細(xì)胞損害,但某些疾病如膽汁淤積型肝炎,盡管肝細(xì)胞受累較輕,血清膽紅素可升高。③新生兒溶血癥:血清膽紅素有助于了解病情的嚴(yán)重程度。④再生障礙性貧血及多種繼發(fā)性貧血(主要見(jiàn)于癌或慢性腎炎引起),血清總膽紅素減少。

2.血清結(jié)合膽紅素 結(jié)合膽紅素與總膽紅素的比值可用于鑒別黃疸類型。①比值< 0.2,見(jiàn)于溶血性黃疸,也見(jiàn)于陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、惡性貧血、紅細(xì)胞增多癥等。②比值0.4~0.6,主要見(jiàn)于肝細(xì)胞性黃疸。③比值>0.6,主要見(jiàn)于阻塞性黃疸。

(二)膽紅素氧化酶法測(cè)定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素

【原理】 膽紅素呈黃色,在450 nm附近有最大吸收峰。膽紅素氧化酶(bilirubin oxidase,BOD)催化膽紅素氧化,其吸光度下降的程度與膽紅素濃度成正比。在p H 8.0條件下,未結(jié)合膽紅素與結(jié)合膽紅素均被氧化,加入十二烷基磺酸鈉和膽酸鈉等陰離子表面活性劑可促進(jìn)氧化,用于總膽紅素測(cè)定;在p H4.5條件下,BOD催化膽紅素單葡糖醛酸酯、膽紅素二葡糖醛酸酯和大部分δ-膽紅素氧化,而未結(jié)合膽紅素不被氧化,測(cè)定其含量代表結(jié)合膽紅素。用溶于人血清中的二?；撬崮懠t素(ditaurobilirubin,DTB)作標(biāo)準(zhǔn)品,檢測(cè)450nm吸光度的下降值可反映結(jié)合膽紅素的含量。

【器材與試劑】

1.器材 試管、試管架、加樣器、恒溫水浴箱、分光光度計(jì)。

2.試劑

(1)0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(p H8.2):取三羥甲基氨基甲烷1.211g、膽酸鈉172.3mg和SDS(十二烷基磺酸鈉)432.6mg,溶于約90ml去離子水,在室溫用1mol/L鹽酸調(diào)p H至8.2,再加蒸餾水至100ml,置冰箱保存。此緩沖液含4mmol/L膽酸鈉和15mmol/L的SDS。

(2)BOD溶液:如系凍干品,按說(shuō)明書復(fù)融后保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。如是液體,置4℃可保存較長(zhǎng)時(shí)間。BOD貯存溶液的酶活性一般在數(shù)千至2萬(wàn)U/L,BOD工作液酶活性按反應(yīng)液中BOD終濃度達(dá)0.3~1.0U/ml計(jì)算。

(3)0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(p H4.5)。

(4)總膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液:342μmol/L。

(5)結(jié)合膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液:將DTB配于膽紅素濃度可忽略不計(jì)的人血清中,或用凍干品按說(shuō)明書要求配制。配制后分裝于聚丙烯管內(nèi),-70℃保存,可穩(wěn)定6個(gè)月。

【操作】

1.總膽紅素測(cè)定 按表9-8進(jìn)行操作。

表9-8　酶法測(cè)定總膽紅素操作步驟

加入BOD工作液后立即混勻,各管置37℃水浴5min,用分光光度計(jì)450nm波長(zhǎng)比色,以蒸餾水調(diào)零,分別讀取各管吸光度。

2.結(jié)合膽紅素測(cè)定 按表9-9進(jìn)行操作。

表9-9　酶法測(cè)定結(jié)合膽紅素操作步驟

立即混勻,置37℃水浴5min,用分光光度計(jì)450nm波長(zhǎng)比色,以蒸餾水調(diào)零,分別讀取各管吸光度。

【計(jì)算】

【參考區(qū)間】 同改良J-G法。

【質(zhì)量保證】

1.BOD濃度的選擇 BOD在反應(yīng)液中的終濃度為0.18~1.14U/ml。BOD濃度的選擇,可根據(jù)所用制品在測(cè)定高膽紅素血清標(biāo)本或342μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)速度(能否在5min反應(yīng)完全而確定)。由于測(cè)定結(jié)合膽紅素時(shí)反應(yīng)液p H偏離BOD的最適范圍,故要求BOD有較高的濃度。一般其終濃度不低于0.5U/ml。

2.渾濁問(wèn)題 黃疸血清或肝素抗凝的血漿,在反應(yīng)15min后,幾乎均產(chǎn)生渾濁而影響結(jié)果。測(cè)定結(jié)合膽紅素應(yīng)選擇p H為4.5,p H<4.0時(shí),血清易渾濁,嚴(yán)重干擾測(cè)定結(jié)果。

【應(yīng)用評(píng)價(jià)】 酶法測(cè)定膽紅素,對(duì)血樣和試劑的耗量少,特異性高,重復(fù)性好。不僅適合手工簡(jiǎn)便操作,也適合自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。測(cè)定總膽紅素時(shí),有更寬的線性范圍(0~513 μmol/L)。高低濃度標(biāo)本的精密度批內(nèi)、批間CV變化不大,回收率在93%~102%,說(shuō)明BOD法測(cè)定總膽紅素的準(zhǔn)確度、精密度比改良J-G法好。脂血和溶血均可使測(cè)定結(jié)果升高。結(jié)合膽紅素的線性范圍在0~342μmol/L內(nèi),批內(nèi)CV在2.5%~2.8%?？垢蓴_能力強(qiáng),血紅蛋白<1.5g/L不產(chǎn)生干擾。

【臨床意義】 見(jiàn)改良J-G法。