實訓二　血液常規(guī)檢查

一、血液常規(guī)檢查(手工法)

實訓目的

血液常規(guī)檢查(blood routine test，BRT)也稱血液一般檢驗或全血細胞計數(shù)(complete blood count，CBC)，是血液檢驗中最基礎和最常用的檢查項目。分為傳統(tǒng)的手工基本項目檢查(紅細胞計數(shù)和血紅蛋白測定、白細胞計數(shù)和白細胞分類計數(shù))和血細胞分析儀多參數(shù)檢查，具有廣泛的臨床應用：①協(xié)助疾病的診斷和鑒別診斷；②病情觀察及預后判斷；③某些疾病治療的監(jiān)護；④術(shù)前準備；⑤協(xié)助傳染病及職業(yè)病的調(diào)查。

實訓準備

雙目電光源顯微鏡、改良牛鮑氏計數(shù)板、721或722分光光度計(含比色杯)、一次性微量吸管、真空負壓采血管(含配套一次性采血針頭)、一次性采血針、小試管、消毒棉簽、75%醫(yī)用酒精、醫(yī)用紗布、吸水紙、壓脈帶、采血墊枕、載玻片、洗耳球、移液管、血細胞稀釋液(紅細胞用、白細胞用、血小板用)、文齊氏轉(zhuǎn)化液、瑞氏染色液、顯微鏡清潔劑、香柏油、血細胞分析儀、聯(lián)機電腦及相應配套試劑(稀釋液、溶血素、清洗液等)、記錄紙、筆等。

實訓內(nèi)容

1.血細胞手工計數(shù)　白細胞、紅細胞、血小板。

2.血紅蛋白測定　測定全血中血紅蛋白濃度。

3.白細胞分類計數(shù)　外周血中中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞及嗜堿性粒細胞占白細胞總數(shù)的百分比。

4.外周血細胞形態(tài)檢查　紅細胞、白細胞、血小板異常形態(tài)檢查、血液寄生蟲檢查等。

實訓方法

1.血細胞手工計數(shù)　操作：①取稀釋液；②采末梢血或靜脈血，進行血液稀釋，混勻；③充池；④鏡檢，計算一定范圍內(nèi)的血細胞數(shù)；⑤換算成每升血細胞數(shù)。各血細胞計數(shù)方法的比較見表2-1。

表2-1　三種細胞手工計數(shù)方法的比較

2.白細胞分類計數(shù)和細胞形態(tài)檢查　操作：①采末梢血或靜脈血；②推制血涂片2～3張；③選擇較好的一張進行瑞氏染色；④干燥后，在顯微鏡下分類計數(shù)100個白細胞，計算報告百分比，并觀察紅細胞、白細胞、血小板異常形態(tài)檢查并注意有無血液寄生蟲等。

3.血紅蛋白測定(HiCN法)　操作：①開啟721或722分光光度計預熱20分鐘；②取 轉(zhuǎn)化液5 ml置于中型試管；③采末梢血20 μl，混勻，放置5分鐘；④調(diào)整分光光度計波長為540 nm，用轉(zhuǎn)化液調(diào)“零”，測定待測品的吸光度值(A)；⑤計算，Hb(g/L)=KA(K值為換算系數(shù)，理想條件下K值為366.7，也可根據(jù)標準品，繪制標準曲線，計算K值)。

4.注意事項

(1)注意基本信息,如姓名、性別、年齡、科室、臨床診斷的相關(guān)資料等。

(2)標本類型和檢查項目，血常規(guī)檢查標本一般為全血抗凝標本，抗凝劑為EDTA-K2(紫色帽)，有時醫(yī)生對項目和方法有特殊要求，如血小板手工計數(shù)。

(3)消除待檢者生理因素如年齡、性別、運動、情緒、飲食、藥物等對結(jié)果的影響，標本采集順利，一針見血。

(4)標本編號，及時檢驗，防止張冠李戴，注意日期和簽名，防止差錯。

實訓結(jié)果

填寫或粘貼檢驗報告單。

實訓思考

1.外周血檢驗血液寄生蟲有哪些？有哪些方法？

2.外周血中核象如何判斷？有何價值？

3.外周血細胞形態(tài)檢查的意義有哪些？

4.正確看待白細胞參數(shù)：白細胞參考范圍是(4.0～10)×109/L，但大多數(shù)“健康”人群在(5.0～7.0)×109/L范圍。如某患者潛在炎癥、感染、壞死、結(jié)締組織病變等，檢查結(jié)果為9.0×109/L，雖然還處于正常范圍，但也說明增高，如果白細胞分類中中性粒細胞增多，更能說明機體對病原的刺激產(chǎn)生了反應。類似的情況還有白細胞不增型的類白血病反應(leukomoid reaction，LR)，雖然白細胞總數(shù)未增高，但外周血白細胞幼稚化，出現(xiàn)明顯的核左移(shift to the left)。

(嚴家來　徐素仿)

二、全自動血液細胞分析儀檢查(BC-5180型)

實訓目的

掌握全自動血液細胞分析儀的原理、使用方法等。熟悉血液白細胞計數(shù)及分類，紅細胞計數(shù)，血小板計數(shù)，血紅蛋白測定，紅細胞壓積，紅細胞體積分布寬度，平均紅細胞血紅蛋白含量，平均紅細胞血紅蛋白濃度，平均紅細胞體積，血小板體積分布寬度、平均血小板體積和血小板壓積等直方圖、散點圖的檢驗意義。

實訓原理

1.電阻抗法原理　本分析儀利用庫爾特原理紅細胞/血小板計數(shù)以及白細胞/嗜堿性粒細胞等進行檢測。檢測樣本經(jīng)過二次稀釋后進入白細胞檢測單元。檢測單元有一個小的開口，叫做檢測小孔。小孔兩側(cè)有一對正負電極，連接恒流電流。由于細胞具有不良導體的特性，稀釋樣本中的細胞在恒定的負壓的作用下通過檢測小孔的時候，電極間的直流電阻就會發(fā)生變化，從而在電極兩端形成一個同細胞體積大小成比例的脈沖信號。當細胞連續(xù)地通過小孔，就在電極兩端產(chǎn)生一連串的電脈沖，脈沖的個數(shù)與通過小孔的細胞數(shù)相當，脈沖的幅度與細胞的體積成正比。將采集到的電脈沖放大后與正常的白細胞/嗜堿性粒細胞體積范圍所對應的通道電壓閾值相比較，計算出電脈沖幅度落在白細胞/嗜堿性粒細胞通道內(nèi)的電脈沖個數(shù)。由此，所有采集到的電脈沖根據(jù)不同的通道電壓閾值進行分類，落在白細胞/嗜堿性粒細胞通道內(nèi)的電脈沖個數(shù)就是白細胞/嗜堿性粒細胞的個數(shù)。依據(jù)脈沖電壓幅度劃分的每一個通道范圍內(nèi)的細胞個數(shù)決定了細胞的體積分布。用橫坐標表示細胞體積、縱坐標表示細胞相對數(shù)量的二維圖就是反映細胞群體分布情況的直方圖。

2.激光流式細胞計數(shù)原理　當一定的血細胞被吸入并經(jīng)過特定量的試劑作用后，血樣經(jīng)噴嘴注入充滿稀釋液的圓錐形的流動室中。在稀釋液形成的鞘液包裹下，細胞單個排列成行地穿過流動室的中央。當懸浮在鞘液中的血細胞經(jīng)過二次加速后通過激光檢測區(qū)時，血細胞受到激光束的照射，產(chǎn)生的散射光性質(zhì)與細胞大小、細胞膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的折射率有關(guān)。低角前向散射光反映了細胞的大小，高角前向散射光則反映細胞的內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)和顆粒物質(zhì)。光電二極管接收這些散射光信號并將其轉(zhuǎn)化為電脈沖，根據(jù)采集到的這些電脈沖數(shù)據(jù)，可以得到血細胞大小及細胞內(nèi)部信息的二維分布圖，稱為散點圖，橫坐標反映細胞的內(nèi)部復雜度信息，縱坐標反映細胞的體積。

實訓內(nèi)容

(一)單樣本測定。

(二)多樣本連續(xù)測定。

實訓準備

全自動血液細胞分析儀BC-5180或BC-5380血液細胞分析儀專用試劑：M-53D稀釋液；M-53LEO(Ⅰ)溶血劑；M-53LEO(Ⅱ)溶血劑；M-53LH溶血劑；M-53清潔液；M-53P探頭清潔液。所有試劑應參照試劑的使用說明進行保存，變質(zhì)、超過效期的所有試劑不能使用，采血針、EDTA-K2抗凝管(紫色帽)、一次性負壓采血針、壓脈帶、試管架、75%醫(yī)用乙醇、碘酒、打印紙、記號筆、一次性手套。

實訓方法

1.開機前準備　檢查試劑是否足量，廢液桶是否為空，管路、電路、打印機連接是否正常。

2.開機和用戶登錄(圖2-1)　將主機左側(cè)的“0/1”電源開關(guān)置于“1”，電源開關(guān)亮，并確認主機上的指示燈亮，打開外置計算機和顯示器，進入操作系統(tǒng)后，雙擊“BC-5180血液分析儀”圖標，運行已安裝的配套軟件，軟件啟動后，在彈出的登錄對話框中，輸入123用戶名和123密碼后，點擊“確定”開始執(zhí)行開機初始化操作，初始化完畢后，可進入“圖形回顧界面”，以查看開機本地的檢測結(jié)果。

圖2-1　開機和用戶登錄

3.本地檢查　在主界面點擊快捷按鈕區(qū)的“圖形回顧”按鈕，檢查顯示在“圖形回顧”界面的本地結(jié)果是否滿足以下要求。

4.每日質(zhì)控　在進行樣本分析前，每日需對分析儀進行質(zhì)控分析。

5.選擇工作模式　見圖2-2、圖2-3。

圖2-2　工作模式

(1)在主界面點擊快捷按鈕區(qū)的“計數(shù)”按鈕，彈出計數(shù)對話框。

(2)點擊模式項的“自動-全血”、“封閉-全血”或者“封閉-預稀釋”單選按鈕選擇需要的工作模式。

(3)點擊“CBC”或“CBC+DIFF”單選按鈕選擇測量模式。

(4)在“樣本編號”框輸入下一個分析樣本的樣本編號。對于“自動-全血”模式，如選擇使用內(nèi)置條碼掃描儀自動錄入下一個分析樣本的編號，點擊“內(nèi)置條碼掃描”復選框，在“管架號”、“試管號”編輯框中輸入起始樣本的管架號和試管號。管架號的輸入范圍為1～100，試管號的輸入范圍為1～100。

(5)設置完成后，點擊“確定”按鈕，保存輸入的內(nèi)容。

(6)操作者也可在樣本分析前，點擊快捷按鈕區(qū)的“工作單”按鈕，錄入和修改待分析樣本的完整工作單信息。

圖2-3　計數(shù)過程

6.封閉進樣全血測量

(1)按儀器上的[開倉]鍵，打開樣本倉門。

(2)混勻用EDTA-K2(1.5～2.2)mg/ml血抗凝的樣本，放到樣本倉門內(nèi)，關(guān)閉樣本倉門。

(3)按主機上的[計數(shù)]鍵，分析儀自動執(zhí)行樣本分析。

(4)分析結(jié)束后，樣本倉門自動打開，可取走樣本。

7.封閉進樣預稀釋測量　執(zhí)行封閉進樣預稀釋測量，要選用規(guī)格為?11×40(mm)的適配器。

(1)在主界面點擊快捷按鈕區(qū)的“加稀釋液”按鈕，樣本倉門自動打開。按照界面提示，取一個干凈的離心管，開蓋放入樣本倉后關(guān)閉倉門。

(2)按主機上的[計數(shù)]鍵，讓分析儀自動排出稀釋液。加稀釋液完畢后，樣本倉門自動打開，取出離心管。操作者也可使用移液器移取180 μl稀釋液到離心管中。

(3)點擊“取消”按鈕，關(guān)閉并退出加稀釋液的操作。

(4)人工采集20 μl血樣注入盛有稀釋液的離心管中，蓋好蓋子后混勻。

(5)將該預稀釋液血樣放置3分鐘后，再次混勻，開蓋后放到樣本倉內(nèi)，關(guān)閉樣本倉門。

(6)按主機上的[計數(shù)]鍵，分析儀自動執(zhí)行樣本分析。

(7)分析結(jié)束后，樣本倉門自動打開，可取走樣本。

8.自動進樣全血測量

(1)如使用內(nèi)置條碼掃描儀自動錄入下一樣本編號，將粘貼好條碼標簽的樣本試管放入試管架。

(2)如未配置內(nèi)置條碼掃描儀，將試管按照樣本編號順序依次放入試管架的各試管位中。

(3)將放置好試管的試管架依次水平放置在進樣器的右側(cè)槽中,將有“MINDRAY”標志的一側(cè)背向主機。一次最多能同時放置4個試管架。

(4)按主機上的[計數(shù)]鍵，分析儀自動執(zhí)行樣本分析。

(5)分析結(jié)束后，所有試管架自動移到進樣器的左側(cè)槽中，可取走樣本。

9.休眠　液路相關(guān)操作停止的時間超出設定的時間間隔后，分析儀會自動進入休眠狀態(tài)。此時，仍可以執(zhí)行與液路無關(guān)的任意操作。操作者也可以在主界面點擊“菜單”按鈕，在彈出的菜單中，選擇“關(guān)閉儀器”→“儀器休眠”，使分析儀進入休眠狀態(tài)。分析儀處于休眠狀態(tài)時，可按主機上的[計數(shù)]鍵取消休眠，也可在主界面上的點擊“菜單”按鈕，在彈出的菜單中選擇“關(guān)閉儀器”→“取消休眠”，使分析儀退出休眠狀態(tài)。

10.關(guān)機　每日工作完畢，在主界面點擊快捷按鈕區(qū)的“關(guān)閉儀器”按鈕執(zhí)行關(guān)機，并按照界面的提示將主機左側(cè)的“0/1”電源開關(guān)置于“0”以關(guān)掉主機電源。在主界面點擊快捷按鈕區(qū)的“退出系統(tǒng)”按鈕，退出終端軟件。按照操作系統(tǒng)的關(guān)機流程關(guān)閉外置計算機及其外接設備。清空廢液桶中的廢液，并妥善處理(圖2-4)。

圖2-4　關(guān)機過程

實訓結(jié)果

填寫或粘貼檢驗報告單。

實訓思考

1.三分群和五分類血細胞分析儀區(qū)別在哪里？

2.報告出現(xiàn)異常的幼稚細胞怎樣處理？

病例分析

1.某李姓農(nóng)民，男性，30歲，主訴：頭昏，發(fā)熱入院。查體：貧血貌，皮膚散發(fā)出血點，淺表淋巴結(jié)腫大，胸骨下端輕壓痛，心肺(-)，腹軟，肝、脾肋下未觸及。實驗室檢查：RBC 4.0×1012/L，HGB 100 g/L，LYM 0.60，GRAN 0.20，MID(三分群血細胞分析儀)0.20。請你思考：①可能的初步診斷是什么？②如何進行進一步檢查以確診？

2.某男孩，1歲。面色蒼白1個月，易疲乏，時而煩躁，納差。查血常規(guī)：Hb 86 g/L，RBC 3.45×1012/L，MCV 68 fL，MCH 20 pg，MCHC 260 g/L。請思考：①最可能的診斷是何種貧血(A.葉酸缺乏性貧血；B.缺鐵性貧血；C.再生障礙性貧血；D.維生素B12缺乏性貧血；E.生理性貧血)？②為什么？

(陳雨京　嚴家來)

【附2.1】　BC-5180型全自動血液細胞分析儀儀器校準

1.儀器校準原則血液細胞分析儀校準周期為一年1～2次。

2.儀器校準步驟

(1)校準用樣本的選擇與定值:選擇EDTA-K2抗凝的新鮮正常的全血樣本(抽血8 ml，平均分為4份)，用標準血液細胞分析儀精確測量白細胞、紅細胞、血紅蛋白、MCV和血小板的平均值、標準差及CV值，其統(tǒng)計結(jié)果作該正常全血樣本的定值(確認各參數(shù)檢測結(jié)果的精密度在儀器說明書要求的范圍內(nèi))。

(2)校準過程

①用1管校準物，連續(xù)檢測11次(第1次檢測結(jié)果不用，以防止攜帶污染)，將結(jié)果記錄，計算出WBC、RBC、HGB、MCV及PLT參數(shù)的平均值、標準差及CV值。

②用上述檢測校準物的均值與定值比較，以判斷是否需要校準儀器。

計算各參數(shù)的均值與定值相差的百分數(shù)(不計正負號)，即偏差，計算公式：

[(均值-定值)/定值]×100%

用偏差與儀器校準的判別標準進行比較。WBC、RBC、HGB、MCV及PLT參數(shù)均值與定值的差異全部等于或小于附表中的第一列數(shù)值時，儀器不需要進行校準，記錄偏差的數(shù)據(jù)。若各參數(shù)均值與定值的差異大于附表中的第二列數(shù)值時，儀器不能校準，需請維修人員檢查原因并進行處理；若各參數(shù)均值與定值的差異在表中第一列與第二列數(shù)值之間時，需要對儀器進行校準，具體校準方法可按說明書的要求進行。

③若儀器需要校準，則計算出WBC、RBC、HGB、MCV及PLT參數(shù)新的校準系數(shù)(儀器原有的校準系數(shù)乘以定值除以所測校準物的均值，即為新的校準系數(shù))。

3.校準結(jié)果的確認　BC-5180血液細胞分析儀校準通過標準條件為：儀器校準后，應重新測試同一份校準物3次。只有當被校準參數(shù)的測定值與定值的差異等于或小于下表第一列數(shù)值，該校準才被認可。

4.質(zhì)量控制　見圖2-5。

圖2-5　質(zhì)控過程

(1)室內(nèi)質(zhì)控

(2)質(zhì)控分析:見圖2-6。

圖2-6　質(zhì)控分析

(3)質(zhì)控圖回顧:見圖2-7。

圖2-7　質(zhì)控圖回顧

(4)質(zhì)控列表回顧：見圖2-8。

圖2-8　質(zhì)控列表回顧

(5)失控處理

①失控原因分析及采取的相應措施:如果質(zhì)控結(jié)果超出質(zhì)控偏差范圍，建議按以下步驟操作，直至問題解決。

A.檢查質(zhì)控編輯內(nèi)容，如輸入有誤，進行修改。

B.執(zhí)行本底檢測，如本底異常，參考“故障處理”進行排除。

C.重新執(zhí)行質(zhì)控計數(shù)。

當質(zhì)控測試超出偏差限，用同瓶質(zhì)控再測試一次，在偏差限范圍則儀器工作正常，如還超偏差限，記錄“室內(nèi)質(zhì)控失控報告單”。

同一批號換一瓶質(zhì)控進行測試2次。如其中一次結(jié)果在偏差限范圍，則儀器工作正常；如都超偏差限，記錄“室內(nèi)質(zhì)控失控報告單”，評估是否對儀器進行校準或維修。

D.確認是否為儀器校準的問題。

E.如果上述步驟都未能得到在控結(jié)果，提示儀器可能出現(xiàn)故障，應聯(lián)系維修人員。

②填寫失控報告

A.操作人員發(fā)現(xiàn)失控后，應立即通報主班。失控期間，失控項目不得發(fā)出報告，如有發(fā)出，應予以追回。盡快查明引起失控的原因，采取相應的糾正措施。

B.糾正完畢后，需填寫失控報告，由經(jīng)手人、專業(yè)組長和科主任簽字，并保存失控處理記錄。

③室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)管理

A.每個月的月末，應對當月的所有質(zhì)控數(shù)據(jù)進行匯總和統(tǒng)計處理，并填寫當月所有測定項目的室內(nèi)質(zhì)控月報表。

B.每個月的月末，應對室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)進行周期性評價。如果發(fā)現(xiàn)有顯著性的變異，就要對質(zhì)控圖的均值、標準差進行修改，并要對質(zhì)控方法重新進行設計。

C.每個月的月末，應填寫該月所有測定項目的室內(nèi)失控情況匯總表。

5.注意事項

(1)電源要求

A.分析儀必須在良好的接地條件下使用；

B.確認輸入電壓符合分析儀要求。

(2)環(huán)境要求

A.正常工作溫度范圍：15～30 ℃；

B.運行溫度范圍：10～40 ℃；

C.正常工作濕度范圍：30%～85%；

D.正常工作大氣壓力范圍：70～106 kPa；

E.環(huán)境應盡可能無塵，無機械振動，無污染，無大噪音源和電源干擾；

F.建議在運行設備之前對實驗室的電磁環(huán)境進行評估；

G.切勿將設備靠近強電磁干擾源，以免影響設備的正常運行；

H.不要靠近電刷型電機、閃爍熒光燈和經(jīng)常開關(guān)的電接觸性設備；

I.避免陽光直射或置于熱源及風源前，選擇一個通風良好的位置；

J.不要將主機放置在斜面上。

(3)故障處理:若出現(xiàn)故障，可點擊界面下方的故障信息區(qū)，獲取故障幫助信息，還可點擊“消除故障”按鈕，一鍵消除所有可消除的故障。

(4)日常維護:每日應執(zhí)行正常關(guān)機。樣本計數(shù)次數(shù)累計已達到或超過1 000次時，應執(zhí)行一次探頭清潔液浸泡；若樣本量較少，分析儀每使用2周應執(zhí)行一次探頭清潔液浸泡。

(陳雨京　嚴家來　王文明)