在研究病毒癌基因的同時(shí)，化學(xué)誘變劑誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)，以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也迅速開展起來了。其中以美國麻省理工學(xué)院溫伯格（R.Weinberg）實(shí)驗(yàn)室的施嘉禾等的開創(chuàng)性研究最具代表性。

埃姆斯等的研究雖然提示細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生是和DNA結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，但并沒有直接的證據(jù)，而施嘉禾等的工作運(yùn)用DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)證明，化學(xué)誘變劑處理后出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化表型的細(xì)胞DNA的確攜帶了決定惡性轉(zhuǎn)化的遺傳信息。他們用3-甲基膽蒽（3-methylcholanthrene，3MC），苯并（α）芘　 [ benzo（α）pyrene，BP]和7，12-二甲基苯并蒽（7，12-dimethylbenzanthracene，DM BA）等化學(xué)致癌物處理各種不同來源的細(xì)胞。然后將出現(xiàn)了惡性轉(zhuǎn)化性狀的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA分離純化，用磷酸鈣共沉法轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞株NIH3T3，借以測定供體DNA在受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化活性。選擇NIH3T3作為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的受體細(xì)胞有兩個(gè)原因：①與其他嚙齒類動(dòng)物來源的細(xì)胞株系相比，NIH3T3吸收具有完整的生物學(xué)活性的DNA片段的效率比較高；②它的生長具有接觸抑制特性，因而能形成透明度高的細(xì)胞單層，易于觀察在單層細(xì)胞上形成的轉(zhuǎn)化細(xì)胞集落。一般來講，用外源DNA轉(zhuǎn)染2～3星期即可觀察結(jié)果。轉(zhuǎn)化細(xì)胞集落的形態(tài)特征是交互疊合生長和高度的折光性，在細(xì)胞單層背景上能形成密集堆砌、染色特深的集落。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裾f明問題的關(guān)鍵是對照的設(shè)置，實(shí)驗(yàn)設(shè)置的對照不但應(yīng)該包括未轉(zhuǎn)染外源DNA的NIH3T3培養(yǎng)物，還應(yīng)該包括一組未經(jīng)誘變劑處理的對照細(xì)胞的DNA的轉(zhuǎn)染對照。此外，為了避免主觀誤差，實(shí)驗(yàn)應(yīng)采用雙盲法。雙盲也包括兩個(gè)方面：①取自轉(zhuǎn)化細(xì)胞和對照細(xì)胞的DNA樣品應(yīng)編碼后轉(zhuǎn)染，不使實(shí)驗(yàn)者知道供體DNA的來源；②在分析受體細(xì)胞克隆是否是轉(zhuǎn)化細(xì)胞集落時(shí)，對所有的培養(yǎng)物進(jìn)行編碼，避免判定的傾向性。直到分析和判定結(jié)束后，再公布編碼內(nèi)容并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。施嘉禾的實(shí)驗(yàn)表明有5株3MC處理后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型的C3H10T1/2細(xì)胞和一株BALB3T3細(xì)胞的DNA具有很高的、可重復(fù)的轉(zhuǎn)移惡性轉(zhuǎn)化活性的能力，每微克轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA可產(chǎn)生0.1～0.2個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞集落。他還進(jìn)一步做了連續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)DNA是惡性轉(zhuǎn)化性狀的遺傳信息載體（表8-2）。

表8-2　轉(zhuǎn)化表型的連續(xù)轉(zhuǎn)移

在這套實(shí)驗(yàn)中，值得注意的還有兩點(diǎn)：①作為轉(zhuǎn)化技術(shù)程序的對照，作者還加了一個(gè)由逆病毒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的陽性對照組；②為了排除第二級轉(zhuǎn)化受第一級轉(zhuǎn)化細(xì)胞污染的可能性，用酶和去污劑去除了供體DNA中的雜質(zhì)，并用限制性內(nèi)切酶Eco R Ⅰ處理和病毒探針雜交等手段判定DNA的細(xì)胞來源。在上述轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，作為供體細(xì)胞的BALB3T3和C3H 10T1/2，與作為受體細(xì)胞的NIH3T3的DNA的Eco R Ⅰ酶切電泳譜是互不相同的。這套設(shè)計(jì)嚴(yán)密而精巧的實(shí)驗(yàn)第一次證明致癌性誘變劑的作用是引起細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)的改變，DNA分子是致癌過程的靶分子，是惡性轉(zhuǎn)化性狀的遺傳信息載體。不久，又進(jìn)一步證明化學(xué)誘變劑處理后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA對裸鼠是有致瘤性的。

施嘉禾等的工作的意義還為我們建立了一套測定DNA片段的惡性轉(zhuǎn)化活性的檢測方法。在短短幾年內(nèi)，多種化學(xué)誘變劑和致癌物處理后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA、多種動(dòng)物腫瘤和人腫瘤細(xì)胞來源的DNA均在這個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中證實(shí)了各自的惡性轉(zhuǎn)化活性。如果配合限制性內(nèi)切酶譜分析，將有可能把攜有轉(zhuǎn)化活性的DNA片段縮短到最低限度，估算出致癌DNA序列的長度，乃至測出其序列。

利用小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3檢測人腫瘤細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)化活性的實(shí)驗(yàn)研究還有一個(gè)意想不到的好處，人們可以利用人類基因組所特有的Alu重復(fù)序列，來分離人腫瘤細(xì)胞中有轉(zhuǎn)化活性的DNA片段（關(guān)于Alu序列可參閱第7章§ 7.4節(jié)），具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

（1）先從人體腫瘤細(xì)胞中提取和純化DNA。

（2）轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。

（3）分離并擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)胞，再提取和純化轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA。

（4）用第一次轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA再次轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，在小鼠細(xì)胞中連續(xù)轉(zhuǎn)化可排除與轉(zhuǎn)化潛能無關(guān)的人源DNA。

（5）從第二次轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離和提純DNA。然后，用限制性內(nèi)切酶做不完全消化，得到長短不等的DNA片段。

（6）與采用同一種內(nèi)切酶處理的噬菌體DNA做基因重組，并將重組DNA包裹于噬菌體的蛋白外殼，制成第二輪轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA的基因文庫（gene library）。

（7）用包裹了重組DNA的噬菌體感染敏感的寄主細(xì)胞并使之形成噬菌斑。再將噬菌斑影印在硝酸纖維膜上，用放射性同位素標(biāo)記的Alu探針做分子雜交，找出含有Alu序列的人源DNA和包裹這段DNA的噬菌體。

（8）擴(kuò)增噬菌體，提取并純化DNA。

（9）做NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，再分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞。擴(kuò)增后分離和純化轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA，然后仍以Alu為探針來分離人體細(xì)胞來源的癌基因。

利用分離到的人體腫瘤細(xì)胞癌基因作為探針，就可以在相應(yīng)的人體正常細(xì)胞中探尋與活化癌基因同源的、無轉(zhuǎn)化活性的原癌基因（protooncogene）。正是這條思路導(dǎo)致了1982年溫伯格領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室和巴瓦西德（M.Barbacid）領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室關(guān)于癌基因結(jié)構(gòu)變異的重大發(fā)現(xiàn)。下面將以溫伯格等的工作為例來討論這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)及其意義。