第二節(jié)　耐異煙肼與katG、inhA和ahpC基因突變

異煙肼（Isoniazid，INH）為最早合成的抗結核藥，和RFP一樣，是重要的一線抗結核藥物。1952年，發(fā)現異煙肼具有強大的抗結核作用，至今仍是現有抗結核藥物中抑菌作用最強的藥物，這被認為是結核病治療史上的一個里程碑。INH結構簡單，僅由一個吡啶環(huán)和一個酰肼基團組成。目前各地報道的INH耐藥率也呈上升趨勢，然而其耐藥機制卻是所有抗菌藥物中最為復雜的一個，至今尚未完全闡述清楚。

INH是前體藥物，需要細菌通過體內代謝使其活化。細菌體內的過氧化氫—過氧化物酶不僅有助于促進INH進入菌體，而且還可以對INH加以化學修飾，使之具有生物活性，從而產生殺菌效應。早在20世紀50年代，就發(fā)現了INH耐藥結核桿菌中過氧化氫—過氧化物酶活性喪失或降低的現象。以后，許多學者對該酶與INH耐藥性的關系進行了大量研究。直到1992年，Zhang等克隆出過氧化氫—過氧化物酶編碼基因（katG），并將這個基因轉移到耐異煙肼的恥垢分支桿菌中，可以恢復該菌對INH的敏感性，從而證實了katG基因與INH耐藥性之間的關系。katG基因的結構已經清楚，其處于上游furA基因和下游embC基因的一個功能區(qū)段。全長2223bp，G＋C含量為64.6%。 katG基因編碼含血紅素酶，即過氧化氫酶—過氧化物酶。其N端編碼作用范圍廣的過氧化物酶，C端編碼過氧化氫酶。此酶在細菌的氧化應激反應中起作用，廣泛存在細菌中。很多細菌含有katG基因，與分枝桿菌katG基因有較高的同源性。在結核桿菌中，katG基因編碼的過氧化氫酶—過氧化物酶能轉化異煙肼成為毒性形式，這種活化的INH形式能與分枝桿菌分枝菌酸生化合成途徑中的編碼烯脂酰載體蛋白（enoyl-ACP）還原酶—NADH復合體結合，抑制其活性，進而干擾分枝菌酸合成，發(fā)揮抗菌作用。katG基因突變后，過氧化氫酶—過氧化物酶空間構型改變，活性降低或喪失，與異煙肼結合能力下降，阻止INH轉換成活性形式，進而導致耐藥性表型。

目前，國、內外通過PCR-SSCP和基因測序等分子生物學技術對大量臨床菌株的katG進行了分析。結果表明，主要是katG基因的點突變與INH的耐藥相關，其中，katG315位突變與INH耐藥的相關性最為明確，在異煙肼耐藥結核分枝桿菌臨床分離株中，50%～70%出現點突變或部分缺失、插入等，最常見的點突變是315位Ser（AGC）→Thr（ACC），315位Ser被視為是決定酶活性的關鍵部位。其他還可見katG基因63位Asp、108位His、104位Arg、108位His、138位Asn、148位Leu、262位Thr、270位His、275位Thr 、312位Trp、350位Ala、381位Asp和629位Gly等密碼子突變。目前也有報道指出，katG的一些突變不影響酶的活性。例如，先前一些文獻都集中對katG基因中315位Ser和463位Arg突變作了報道，認為這兩種突變和耐藥性關系最密切。但近年來一些學者認為，463位Arg不影響酶活性，生化和流行病學資料也證實463位Arg→Leu的突變與INH耐藥無關。

INH耐藥性相關的另一個基因是inhA基因，由Banerjee等于1994年首先克隆出來。inhA基因全長810bp，編碼enoyl-ACP還原酶，其上游是mabA基因，二者相距21bp，inhA和mabA基因共同組成一個操縱子，轉錄起始于mabA基因上游的啟動子。inhA基因參與結核桿菌分枝菌酸的合成，編碼產物是enoyl-ACP還原酶（InhA）。該酶在脂肪酸合成循環(huán)反應的最后一步起作用，將不飽和脂肪酸轉化為飽和脂肪酸，參與長鏈脂肪酸的延長，并進一步被分枝桿菌用于合成分枝菌酸，分枝菌酸是分枝桿菌細胞壁的重要組成部分，是一種長鏈且?guī)戎Φ闹舅幔?0～90個碳原子，能維持細菌菌體的完整性）。 INH通過抑制分枝菌酸的生物合成會引起一系列反應而導致細菌變形、分解并死亡。Rozwarski等（1998年）研究證實，InhA是活化的INH的原始靶位，INH特異地結合于InhA的輔助因子（NADH還原型輔酶Ⅰ），形成加和物，此加和物可共價結合于InhA的NADH結合位點，滅活InhA，產生殺菌作用。一旦InhA突變，InhA結構改變，導致InhA對NADH親和力下降，即使異煙酰-NADH復合物已經形成，也難以影響InhA的酶活性，從而形成對異煙肼的耐藥性。一些研究者報道了臨床菌株中inhA的突變情況，但結果不盡一致。Basso等對異煙肼耐藥菌株inhA進行了測序，發(fā)現5株inhA結構基因存在下列突變：Ile16Thr（ATC→ACC），I1e21Val（ATC→GTC），Ile47Thr（ATT→ACT），Val78Ala（GTG→GCG）和Ile95Pro（ATT→CCT），且不伴其他突變。在異煙肼敏感菌株中未發(fā)現這些氨基酸替換。但更多的研究報道顯示，結核桿菌多為啟動子區(qū)發(fā)生突變，突變率在10%左右，突變發(fā)生在位于mabA起始密碼子上游的核糖體識別結合位點（RBS），突變造成轉錄上調，通過使InhA蛋白過量表達，造成細胞內InhA濃度增高，來抵抗INH的選擇壓力，導致耐藥產生。

1996年，Wilson等報道了另一個與結核桿菌INH耐藥性有關的基因，即ahpC基因。ahpC基因全長588bp，其編碼烷基過氧化氫還原酶（AhpC），AhpC蛋白具有解除過氧化氫毒性的作用。Ferrari等（1999年）也報道結核桿菌可以抵抗宿主細胞內有毒成分——過氧化氫、超氧陰離子和單個氧分子等，而AhpC在其中發(fā)揮著重要作用。臨床研究表明，在katG基因缺失的菌株中發(fā)現同時存在ahpC調節(jié)基因的突變，導致ahpC基因表達增加，這可能是菌體內喪失過氧化氫酶活性后的一種代償性選擇的結果。實驗研究表明，將ahpC基因轉入耐多藥結核桿菌并不能恢復后者對結核桿菌的敏感性，提示ahpC基因可能對INH耐藥不產生直接影響，但由于katG功能喪失往往伴隨ahpC調節(jié)基因的突變所導致的AhpC表達上升，故它可作為監(jiān)測INH耐藥的一個有用指標。 Kelley等（1997年）利用克隆測序分析，發(fā)現在過氧化物酶陰性、katG基因變異的耐INH菌株，其ahpC基因調節(jié)序列啟動子區(qū)域-6bp，-9bp，-10bp，-12bp，-30bp，-42bp處有C→T突變存在，并與轉錄的精確起始有關；但在過氧化物酶陽性、無katG基因變異的耐INH菌株，卻未見序列的變異。也提示ahpC基因突變可不直接導致耐藥，而僅作為katG基因突變的補充。