一、酚試劑法測(cè)定血清蛋白質(zhì)含量（改良Lowry法）

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1．學(xué)習(xí)酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。

2．掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法及分光光度計(jì)的使用。

【實(shí)驗(yàn)原理】

這是根據(jù)酚試劑（磷鉬酸、磷鎢酸為主要成分）與蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的顯色反應(yīng)及蛋白質(zhì)與堿性銅試劑和雙縮脲反應(yīng)的復(fù)合法。

蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性溶液中與Cu2＋絡(luò)合產(chǎn)生紫紅色化合物（雙縮脲反應(yīng)）同時(shí)使肽鏈展開(kāi)，其中帶有酚基的酪氨酸殘基充分暴露，后者在堿性條件下使酚試劑中磷鎢酸和磷鉬酸還原生成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的化合物，其藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行比色，即可計(jì)算出測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的含量。

【實(shí)驗(yàn)器材】

試管；100ml容量瓶；50ml容量瓶；分光光度計(jì)；血清。

【實(shí)驗(yàn)試劑】

1．堿性銅試劑：

甲液：稱取無(wú)水碳酸鈉2．0g，溶于0．1mol／L氫氧化鈉溶液100ml中；

乙液：取硫酸銅（CuSO4·5H2O）0．5g溶于1%酒石酸鉀溶液100ml中。

臨用前取甲液50ml，乙液1ml混合，即為堿性銅試劑。

2．0．9%氯化鈉溶液。

3．標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（250μg／m1）準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)牛血清清蛋白25mg，溶于0．9%氯化鈉溶液中，以容量瓶定容至100ml。

4．酚試劑制備　取鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100g和鉬酸鈉（Na2M0O4·2H2O）25g，溶于700ml蒸餾水中，再加入85%磷酸50ml和濃鹽酸100ml混合，置1　500ml圓底燒瓶中溫和地回流10h，回流結(jié)束后加入硫酸鋰（LiSO4·H2O）150g，水50ml，溴3～4滴，除去回流裝置，繼續(xù)沸騰15min，除去剩余的溴。冷卻后稀釋至1　000ml，過(guò)濾，溶液應(yīng)呈黃色或金黃色（如帶綠色者不能使用，應(yīng)繼續(xù)加溴煮沸），置于棕色瓶中保存。使用前以酚酞為指示劑，用0．1mol／L氫氧化鈉溶液滴定，求出酚試劑的摩爾濃度，然后根據(jù)此濃度，將酚試劑用蒸餾水稀釋至濃度為1mol／L（滴定時(shí)可將酚試劑稀釋，以免顏色影響）。試劑放置過(guò)久，變成綠色時(shí)，可再加溴數(shù)滴煮沸15min，如能恢復(fù)原有的金黃色，則仍可繼續(xù)使用。

目前，酚試劑有成品出售。

【實(shí)驗(yàn)方法】

1．稀釋血清的制備　取血清0．1ml，置50ml容量瓶中，用0．9%氯化鈉溶液稀釋至刻度處，混勻，此為待測(cè)血清樣品。

2．測(cè)定方法　有標(biāo)準(zhǔn)曲線法和直接計(jì)算法。標(biāo)準(zhǔn)曲線法取7支試管按表2－1操作；直接計(jì)算法用附表1中1、3、7三支試管操作，分別為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管。操作程序二者完全相同。

附表1　酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)的操作步驟

混勻，室溫放置30min，在波長(zhǎng)650nm比色，以l管（空白管）調(diào)零，讀取各管光吸收值。

以2～6管蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

計(jì)算：以7管（測(cè)定管）光吸收值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得血清蛋白質(zhì)含量。

或按附表1中的3管為標(biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行計(jì)算。

【注意事項(xiàng)】

1．各管加入酚試劑后應(yīng)立即搖勻，不應(yīng)出現(xiàn)渾濁；

2．堿性銅試劑必須新鮮配制；

3．標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液需先用凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)純度，然后進(jìn)行配制；

4．本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同蛋白質(zhì)定量變動(dòng)較大，凡具有還原性的物質(zhì)對(duì)此實(shí)驗(yàn)都有干擾。

二、考馬斯亮藍(lán)G－250染料結(jié)合比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1．學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)G－250染料結(jié)合比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。

2．掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及分光光度計(jì)的使用。

【實(shí)驗(yàn)原理】

考馬斯亮藍(lán)G－250（coomassie brilliant blue，G－250）為醇溶性蛋白質(zhì)染料。在酸性環(huán)境中，蛋白質(zhì)帶正電荷（－NH＋3）與考馬斯亮藍(lán)G－250陰離子結(jié)合為藍(lán)色的“染料－蛋白質(zhì)”復(fù)合物，其最大吸收峰為595nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，其光吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比。本法適用于測(cè)定10～100μg的不同濃度蛋白質(zhì)溶液。

【實(shí)驗(yàn)器材】

試管；分光光度計(jì)。

【實(shí)驗(yàn)試劑】

1．考馬斯亮藍(lán)G－250染色液　準(zhǔn)確稱取考馬斯亮藍(lán)G－250　100mg溶于25ml甲醇中，加水800ml，加85%磷酸（W／V，A·R）100ml，混勻，再加水至1　000ml，置棕色瓶?jī)?nèi)，于4℃冰箱保存可用1個(gè)月。

2．標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液　每毫升含標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)1　000μg（多用標(biāo)準(zhǔn)的牛血清清蛋白或人血清清蛋白。若測(cè)定人血清蛋白質(zhì)含量，可用正常人混合血清經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量后，稀釋?xiě)?yīng)用）。

【實(shí)驗(yàn)方法】

1．制備標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋系列　首先取試管5支，按附表2操作。

附表2　標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液制備

2．繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線　另取7支試管，編號(hào)為0，1＇～6＇，按表附表3操作：

附表3　蛋白含量測(cè)定的操作步驟

將以上試管內(nèi)試液搖勻，靜置2min，于波長(zhǎng)595nm以空白管調(diào)零，讀取各管光吸收值。以1′～5′管的蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3．檢測(cè)液蛋白含量計(jì)算　以6′管光吸收值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)樣品中蛋白質(zhì)含量。

【注意事項(xiàng)】

1．本法操作簡(jiǎn)便、靈敏、重復(fù)性好，而且顯色迅速，約2min內(nèi)即可與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，至少1h內(nèi)呈色穩(wěn)定。隨時(shí)間延長(zhǎng)，“染料－蛋白質(zhì)”復(fù)合物會(huì)逐漸形成細(xì)小顆粒，以至沉淀。

2．不同蛋白質(zhì)在同樣酸性條件下所帶正電荷量不同，故與染料結(jié)合的程度也不同，以至同一濃度的不同蛋白質(zhì)顯色度有差異。為此要求蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品要純；標(biāo)準(zhǔn)品與染料結(jié)合的色調(diào)和待測(cè)樣品與染料結(jié)合的色調(diào)要相似。

3．蛋白質(zhì)與本試劑反應(yīng)時(shí)只需輕輕搖勻即可，切勿劇烈震蕩，以防產(chǎn)生泡沫，降低顏色深度。

4．比色杯上染料的清洗方法用甲醇、乙醇或其他有機(jī)溶劑（如氯仿、丙酮）清洗，也可用0．1mol／L HCl浸泡，數(shù)小時(shí)后藍(lán)色黏附物即可除去。

5．此法只適用于可溶性蛋白，對(duì)于膜結(jié)合蛋白、細(xì)胞及細(xì)胞器等，則需用酸堿或去污劑處理后方可測(cè)定。

（楊江蘇）