實(shí)驗(yàn)一　培養(yǎng)基的配制

一、目的要求

1．掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。

2．了解常用的培養(yǎng)基及其作用。

二、實(shí)驗(yàn)原理

培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中，微生物種類繁多、營養(yǎng)類型多樣，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。不同種類的培養(yǎng)基中，一般應(yīng)含有水分、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因素等。不同微生物對(duì)pH要求不一樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的pH一般是偏酸性的，而細(xì)菌和放線菌的培養(yǎng)基的pH一般為中性或微堿性的（嗜堿細(xì)菌和嗜酸細(xì)菌例外）。所以配制培養(yǎng)基時(shí)，都要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基的pH調(diào)到合適的范圍。

此外，由于配制培養(yǎng)基的各類營養(yǎng)物質(zhì)和容器等含有各種微生物，配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。

根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基；按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分為固體培養(yǎng)基（含1．5～2．0%瓊脂，可供微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)、菌種保藏等用）、半固體培養(yǎng)基（含0．5～0．7%瓊脂，常用來觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的特征、菌種保存等）、液體培養(yǎng)基；按用途分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如肉湯培養(yǎng)基）、加富培養(yǎng)基（如血平板和巧克力平板）、鑒別培養(yǎng)基（如EMB培養(yǎng)基）、選擇培養(yǎng)基（如SS培養(yǎng)基）等。

目前已有各種商品化的“干燥培養(yǎng)基”成品出售。這種培養(yǎng)基是將新鮮配制的液體培養(yǎng)基用噴霧干燥法、真空干燥法、低溫干燥法或蒸發(fā)干燥法等將培養(yǎng)基內(nèi)所含的水分去掉；或?qū)⑴囵B(yǎng)基內(nèi)的各種固形成分經(jīng)適當(dāng)處理、充分混勻，制成干燥粉末而成。使用時(shí)只要按比例加入一定量的水，經(jīng)溶解、分裝，高壓蒸汽滅菌，即可使用。這種培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是配制省時(shí)，攜帶方便，使用簡易，質(zhì)量穩(wěn)定。

培養(yǎng)基制備的基本過程包括調(diào)配成分、溶解、校正pH、是容過濾澄清、分裝、滅菌、質(zhì)量檢查和保存。

（1）調(diào)配成分：按培養(yǎng)基處方用量準(zhǔn)確稱取各種成分。

（2）溶解：加適量蒸餾水使其充分溶解，必要時(shí)可稍稍加熱，定容。

（3）校正pH：一般將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7．2～7．6之間。經(jīng)高壓滅菌后其pH可發(fā)生0．1～0．2的變動(dòng)。若用NaOH校正，高壓滅菌后pH下降0．1～0．2；若用Na₂CO₃校正，高壓滅菌后pH升高0．1～0．2。

（4）過濾澄清：自配的培養(yǎng)基通常有一些混濁或沉淀，需過濾澄清后方可使用。液體或半固體培養(yǎng)基常用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基在熔化后趁熱用絨布或雙層紗布加脫脂棉過濾。

（5）分裝：①基礎(chǔ)培養(yǎng)基，一般分裝于容量為500mL錐形瓶滅菌后備用，以便隨時(shí)傾注制平板或配制營養(yǎng)培養(yǎng)基等；②瓊脂斜面：通常在融化后分裝于試管，量為試管高度的1/4～1/3，加塞后滅菌，趁熱擺成斜面；③半固體培養(yǎng)基：分裝量為試管容量的1/4～1/3，加塞滅菌后趁熱直立凝固；④瓊脂高層培養(yǎng)基；分裝量為管長的2/3（接種厭氧菌用），滅菌后趁熱直立凝固；⑤瓊脂平板：先將滅菌瓊脂融化后冷卻至50℃左右，以無菌操作傾注于滅菌平皿內(nèi)（內(nèi)徑90mm的平皿，13～15mL），輕輕搖勻，待瓊脂凝固后將平皿翻轉(zhuǎn)，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（6）滅菌：①由耐熱物質(zhì)配制成的培養(yǎng)基（如普通營養(yǎng)瓊脂等）常用高壓蒸汽滅菌，條件為0．1MPa（1．05kg/cm²），121．3℃，15～20min；含糖培養(yǎng)基以0．06MPa（0．59kg/cm²），112．6℃，10～15min為宜，以免破壞糖類物質(zhì)；②不耐高熱的物質(zhì)配制成的培養(yǎng)基，如糖類、明膠和牛乳等常用流通蒸汽滅菌，方法是加溫到80～100℃，30min，每天1次，連續(xù)3天；③富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基（如含血清或雞蛋清的培養(yǎng)基）需用血清凝固器滅菌，方法是將配制好的培養(yǎng)基擺放在血清凝固器內(nèi)（一般做成斜面）滅菌，第1天75℃，30min，第2天80℃，30min，第3天85℃，30min，在3次滅菌的間隙將培養(yǎng)基取出，置35℃孵箱中過夜；④對(duì)高營養(yǎng)液態(tài)的不耐熱培養(yǎng)基，如血清、細(xì)胞培養(yǎng)液等，則可用過濾除菌。

（7）質(zhì)量檢查：須做無菌試驗(yàn)和效果試驗(yàn)。①無菌試驗(yàn)；將滅菌后的培養(yǎng)基置35℃孵育24h，無任何細(xì)菌生長為合格；②效果試驗(yàn)：將已知的標(biāo)準(zhǔn)參考菌株接種于待檢培養(yǎng)基中，檢查細(xì)菌的生長繁殖狀況和生化反應(yīng)是否與預(yù)期的結(jié)果相符合。

（8）保存：制備好的培養(yǎng)基應(yīng)注明名稱、制作日期，如瓊脂平板應(yīng)將底在上蓋在下（帶培養(yǎng)基的平皿），用牛皮紙包裹或裝于保鮮袋內(nèi)，以減少水分蒸發(fā)。液體培養(yǎng)基應(yīng)直立放置，制作好的培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處或4℃冰箱。

下面介紹幾種常用培養(yǎng)基：

（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（肉湯培養(yǎng)基）。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供微生物生長繁殖之用?；A(chǔ)培養(yǎng)基含有牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而氯化鈉提供無機(jī)鹽。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此要用稀酸或稀堿將其pH調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長繁殖。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：

根據(jù)需要加入1．5%～2．5%（一般為1．8%）的瓊脂成營養(yǎng)瓊脂，加入0．2%～0．7%（一般為0．5%）瓊脂，則成半固體培養(yǎng)基。

（2）血液瓊脂培養(yǎng)基（巧克力瓊脂）。血液瓊脂培養(yǎng)基是一種含有脫纖維動(dòng)物血（一般用兔血或羊血）的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。因此除培養(yǎng)細(xì)菌所需要的各種營養(yǎng)外，還能提供輔酶、血紅素等特殊生長因子。因此血液瓊脂培養(yǎng)基常用于培養(yǎng)、分離和保存對(duì)營養(yǎng)要求苛刻的某些病原微生物。此外，這種培養(yǎng)基還可用來測定細(xì)菌的溶血作用。

血液瓊脂培養(yǎng)基的配方如下：

按牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂）方法制備、分裝、滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至45～50℃時(shí)，以無菌操作加入無菌脫纖維血至10%（臨用前37℃水浴預(yù)溫30min），立即搖勻（避免產(chǎn)生氣泡），分裝于無菌試管和平皿內(nèi)，凝固后即成血液瓊脂斜面或血液瓊脂平板。

若基礎(chǔ)培養(yǎng)基溫度在70～80℃時(shí)加入血液，并在80℃水浴中搖勻15～20min，傾注于平板后即成巧克力瓊脂平板。如圖1－1所示。

圖1－1　血平板和巧克力平板

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法

（一）肉湯培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂）的制備

1．材料。

牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、蒸餾水、量筒、電子秤、試管、試管帽、錐形瓶等。

2．方法。

（1）稱量：（4人一組）。

根據(jù)培養(yǎng)基配方（牛肉膏3%、蛋白胨10%、氯化鈉5%），按500mL的用量準(zhǔn)確稱取各試劑，加入適量蒸餾水充分溶解，定容，調(diào)pH到7．2～7．6。

（2）分裝：（4人分為A組和B組）。

A組：配半固體培養(yǎng)基。取30mL稀釋后培養(yǎng)液加0．5%瓊脂，加熱溶解，分裝小試管10支，每支3mL；

液體培養(yǎng)基。取20mL稀釋后培養(yǎng)液分裝小試管6支，每支3mL。

B組：配斜面培養(yǎng)基。取30mL稀釋后培養(yǎng)液加1．8%瓊脂，加熱溶解，分裝中試管5支，每支6mL；

配液體培養(yǎng)基。取20mL稀釋后培養(yǎng)液分裝小試管6支，每支3mL。

剩余400mL培養(yǎng)液置500mL錐形瓶中，加1．8%瓊脂。

（3）包扎、標(biāo)記。標(biāo)記內(nèi)容：培養(yǎng)基種類、班級(jí)、姓名、日期。

（4）濕熱高壓滅菌。121℃，20min進(jìn)行滅菌。

（5）擺斜面。實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放一木條，厚度為1cm左右。將試管頭部枕在木條上，使管內(nèi)培養(yǎng)基自然傾斜，凝固后即成斜面培養(yǎng)基。

（6）倒平板。將剛剛滅過菌的盛有培養(yǎng)基的錐形瓶和培養(yǎng)皿放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，點(diǎn)燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下塞子，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開培養(yǎng)皿蓋，右手迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿約倒入15mL（以鋪滿皿底為度），平放在臺(tái)子上，待培養(yǎng)基凝固后，進(jìn)行無菌檢測。

（7）無菌檢測。將滅菌完成后的培養(yǎng)基置37℃，孵育24h，若無菌生長則菌檢合格，可以使用。

3．結(jié)果記錄及分析。

記錄所配培養(yǎng)基情況，并分析原因。

四、思考與討論

1．培養(yǎng)基調(diào)配溶解。先在錐形瓶底加入少量水，再加入蛋白胨等成分，以防其粘瓶底燒結(jié)。制備大量培養(yǎng)基，除玻璃容器外，還可用搪瓷缸，但不可用鐵、銅容器，以免鐵、銅離子進(jìn)入培養(yǎng)基；因培養(yǎng)基中含鐵量超過0．14mg/L時(shí)可抑制細(xì)菌毒素的產(chǎn)生，含銅量超過0．3mg/L時(shí)可抑制細(xì)菌生長。需在培養(yǎng)基中加染料、膽鹽、指示劑等，應(yīng)在校正pH后加入。

2．培養(yǎng)基的澄清。如需要制備十分澄清的培養(yǎng)基，可用卵蛋白加熱澄清法。其方法為：取一個(gè)蛋的卵蛋白加水20mL，攪拌至出現(xiàn)泡沫，倒入1000mL液體或熔化的固體培養(yǎng)基中混勻，然后在流動(dòng)蒸汽中加熱30～60min，使培養(yǎng)基中不溶性物質(zhì)附著于凝固蛋白，取出后以紗布夾脫脂棉（固體培養(yǎng)基）或?yàn)V紙（液體或半固體培養(yǎng)基）過濾即可。

3．斜面擺放。斜面擺放若培養(yǎng)基溫度過高，凝固過程中遇外界溫差過大形成大量冷凝水留在斜面底部，影響細(xì)菌生長，而且容易污染。必要時(shí)刻在斜放的試管上覆蓋紗布保溫，減少溫差，自然冷卻。

一般制作斜面培養(yǎng)基時(shí)，每支Φ15×150mm的試管，裝3～4mL（1/4～1/3試管高度），擺放后斜面的長度不超過試管長度的1/2為宜。

4．平板的傾注。傾注培養(yǎng)基時(shí)，切勿將皿蓋全部開啟，以免空氣中塵埃及細(xì)菌等微生物落入。傾注時(shí)若培養(yǎng)基溫度過高，則冷凝水過多，易致污染，不易分離到菌落；若溫度過低，部分瓊脂凝固，傾注時(shí)平板表面會(huì)高低不平?？稍跓o菌室或接種罩內(nèi)傾注培養(yǎng)基后，將皿蓋稍開一縫隙，在紫外燈照射下待凝，這樣利于蒸汽散發(fā)，減少平板內(nèi)冷凝水。

傾注血液瓊脂時(shí)，由于加血時(shí)瓊脂表面容易產(chǎn)生氣泡，傾注時(shí)適時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)錐形瓶，使氣泡附于瓶壁，以減少血平板表面的氣泡。