第三節(jié)　藻毒素的檢測

目前，我國執(zhí)行的《生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》（2001年頻布）和《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》（GB3838-2002）都包含了微囊藻毒素的檢測項目。世界衛(wèi)生組織（WHO）在其推薦的《飲用水標準指導(dǎo)》（第二版）中也增加了微囊藻毒素等指標（WHO，1998）。加拿大健康組織規(guī)定飲水中可接受的藻毒素標準為0.5μg/L（Guidelines for Canadian Drinking Water Quality，1993），澳大利亞學(xué)者建議1 μg/L的含量為安全飲用水的上限。

藻毒素的檢測分析方法主要有生物分析法、化學(xué)分析法和生化分析法，下面就各種方法具體說明。

一、生物分析法

傳統(tǒng)的生物分析法通常用小鼠腹腔注射或口腔灌喂評價微囊藻毒素的毒性（圖4-4）。用純化的MC或藍藻水華粗提藻毒素進行測試，根據(jù)其生理病變及半致死量可初步確定其毒性，多數(shù)MC的LD₅₀為60~70 μg/kg。此外還有用無脊椎動物如蝦、貝、水蚤及其卵進行毒性評價的研究，以細菌進行生物分析也有報道。這類方法靈敏度較差，所得到的毒型結(jié)果與小鼠的品系有關(guān)，可比性較差，且無法確定毒素的類型及結(jié)構(gòu)。

圖4-4 小鼠口腔灌喂或腹腔注射法評價MC的毒性

二、化學(xué)分析法

目前，對MC的化學(xué)檢測常采用HPLC/UV法。一般步驟是先采用正相或反相色譜柱對毒素進行固相萃取分離，將純化后的毒素進行紫外檢測（圖 4-5）。

將被測毒素與標準毒素的滯留時間（即出峰時間）進行比較，可對被測毒素的種類進行鑒定；將被測毒素與標準毒素的峰面積進行比較，可對某種毒素進行精確定量，檢測限一般為ng級。目前還有用質(zhì)譜與色譜串聯(lián)檢測藻毒素的方法，由于LC-MS/MS具有優(yōu)良的選擇性，對樣品的純化步驟要求不高，能夠在混合物中同時實現(xiàn)多種藻類毒素的分離和鑒定．

圖4-5 利用高效液相色譜法檢測藻毒素

三、生化分析法

1. 免疫檢測技術(shù)

最早的免疫檢測是免疫化學(xué)技術(shù)中的一種分析方法，1960年由Yalow和Berson開創(chuàng)，用于檢測血液中的胰島素。從此，免疫檢測廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化學(xué)分析領(lǐng)域檢測激素、藥品、病毒等。免疫檢測的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，以一種抗體或多種抗體作為分析試劑，對待測物進行定性或定量分析?？贵w是一種免疫球蛋白，它由動物機體對外來物質(zhì)（抗原）應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生，抗體可以和抗原物質(zhì)形成抗原—抗體復(fù)合物。在免疫化學(xué)分析方法中，未反應(yīng)的抗原和抗體被稱做自由相，抗原—抗體復(fù)合物被稱做結(jié)合相?？乖涂贵w之間的反應(yīng)具有特異性，并且非常靈敏，從而出現(xiàn)了免疫化學(xué)檢測方法。

自20世紀80年代開始，酶聯(lián)免疫吸附方法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）開始用于MC的監(jiān)測。水質(zhì)免疫檢測中最常用的方法是競爭性非勻相酶聯(lián)免疫檢測，通常將抗體包被在96孔酶標板的微孔底部或其他固定相上，把酶標記在已知濃度半抗原上，以便產(chǎn)生可以檢測的信號。在待測半抗原和已知濃度的酶標記和抗體形成復(fù)合物之后，將剩余的試劑洗脫后加入酶的底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)。根據(jù)是否顯色判別樣品中是否有分析物存在，根據(jù)顏色的深淺定量抗原。

Chu等人首先提出了應(yīng)用ELISA監(jiān)測MC的完整步驟，他們將MC-LR與牛血清蛋白偶聯(lián)，用得到的偶聯(lián)物免疫兔制備兔抗MC-LR多克隆抗體（PAb），然后將MC-LR與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，以鄰苯二胺（OPD）為底物，用直接競爭法做ELISA，用不同濃度的標準毒素MC-LR作標準曲線，根據(jù)底物的顯色程度與標準曲線作比較即可求出毒素的含量，監(jiān)測限為0.2 μg/L。他們發(fā)現(xiàn)抗MC-LR PAb與MC-LR，MC-RR，MC-YR有較好的交叉反應(yīng)性，但與MC-LY，-LA的交叉反應(yīng)性低。McDermott等用從雞蛋黃中提取的抗MC-LR PAb做ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)檢測限度為95 ng/L。這種方法制備的抗體產(chǎn)量大，方法簡便，并且對MC-LR和MC-RR有良好的交叉反應(yīng)性。盡管抗MC的單克隆抗體（MAb）很早就已制備，但直到1995年才由Nagata等建立起一套完整的方案，其監(jiān)測限為25 ng/L。最近，他們又制備了能夠特異性的識別抗MC-MAb和MC形成的免疫復(fù)合體（Immune complex）。

2. 細胞毒性檢測技術(shù)

細胞毒性檢測技術(shù)是利用毒素對細胞的毒性作用來檢測毒素的技術(shù)，不僅可以判斷毒素存在與否，而且可以對毒素進行精確的定量。

Fladmark等建立了一種根據(jù)MC導(dǎo)致鮭魚或大鼠肝細胞凋亡的程度來確定MC含量的方法。他們將分離的鮭魚或大鼠的肝細胞懸浮培養(yǎng)，然后加入MC，根據(jù)細胞凋亡的程度即可求出MC的含量，檢測限度為10~20ng。動物細胞凋亡的第一個信號是發(fā)生凋亡的細胞與鄰近的細胞分離。根據(jù)這一特性，F(xiàn)ladmark等還建立了用MC導(dǎo)致懸浮培養(yǎng)的鮭魚或大鼠肝細胞解聚的程度來檢測毒素的方法，所得結(jié)果比用判斷細胞凋亡程度的結(jié)果靈敏5~10倍。

3. 蛋白磷酸酶抑制試驗

由于MC是蛋白磷酸酶（PP1）和蛋白磷酸酸酶（PP2A）的強烈抑制劑，因此可以通過對酶活性的抑制程度來檢測藻毒素。自Holmes等提出蛋白磷酸酶抑制檢測（Protein phosphatase inhibition assay，PPIA）技術(shù)以來，這種技術(shù)得到了迅速發(fā)展。PPIA多數(shù)以32P標記的糖原磷酸化酶a為底物。由于糖原磷酸化酶a只能被PP1和PP2A水解，而PP1和PP2A又可被MC等抑制，因此在MC、PP和糖原磷酸化酶反應(yīng)后根據(jù)PP水解糖原磷酸化酶a釋放出32P的量就可計算出毒素的量。一般用不同濃度的標準毒素MC-LR作標準曲線，用MC-LR的量來代表總毒素的量。隨著對硝基苯酚磷酸酯（pNPP）可被PP水解現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，人們建立了一種以pNPP為底物的磷酸酶抑制比色檢測技術(shù)，根據(jù)pNPP被水解后產(chǎn)生的有色產(chǎn)物的多少來確定毒素的量。PPIA的檢測限度為pg級，它檢測的是能抑制PP的總毒素的量，而不是某一種毒素的量。所測物質(zhì)被稱為MCs類物質(zhì)，并以MC-LR當量作為結(jié)果，但藍藻本身具有的內(nèi)源蛋白磷酸酶活性有可能使PPIA的結(jié)果偏低。

表4-3 藍藻毒素不同的檢測方法