實驗二　Folin酚法(Lowry法)測定蛋白質(zhì)的含量

【實驗目的】

1．掌握Lowry法測定蛋白質(zhì)含量的原理。

2．了解Lowry法的優(yōu)缺點和適用范圍。

【實驗原理】

在強堿性溶液中，雙縮脲(NH₂-CO-NH-CO-NH₂)與CuSO₄生成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有酰胺基或兩個直接連接的肽鍵的物質(zhì)都有雙縮脲反應，因此蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境下也能與銅離子發(fā)生雙縮脲反應。

Folin酚甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉絡合銅鹽溶液起作用，生成紫紅色蛋白質(zhì)-銅絡合物。

Folin酚乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成。此試劑在pH=10的堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，呈藍色反應(鉬藍和鎢藍的混合物)，顯色隨時間不斷加深。在一定的反應時間和蛋白濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量與藍色深淺成正比。因此可以通過可見光分光光度計測定650 nm處的光吸收值，利用標準曲線法測定蛋白質(zhì)的濃度。

Lowry法的優(yōu)點:靈敏度高，最低能檢測0．005 mg/ml的蛋白質(zhì)，通常檢測范圍是0．02～0．25 mg/ml;也適用于測定酪氨酸、色氨酸的含量。

Lowry法的缺點:費時;因為顯色隨時間不斷加深，需要精確控制操作時間，以保證每管的顯色時間一致;專一性較差，干擾物質(zhì)較多。干擾雙縮脲反應的基團(如-CO-NH₂、-CH₂-NH₂、-CS-NH₂)以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑(如Tris緩沖劑以及蔗糖、硫酸銨、巰基化合物)均可干擾Lowry反應。此外，干擾酚類呈色反應的酚類及檸檬酸也影響實驗結(jié)果。濃度較低的尿素(約0．5%左右)、胍(0．5%左右)、硫酸鈉(1%)、硝酸鈉(1%)、三氯乙酸(0．5%)、乙醇(5%)、乙醚(5%)、丙酮(0．5%)等溶液對顯色無影響。這些物質(zhì)濃度高時，必須做校正曲線。若樣品酸度較高，顯色后色淺，則必須提高碳酸鈉-氫氧化鈉溶液的濃度1～2倍。

因為Folin酚乙試劑僅在酸性pH值條件下穩(wěn)定，而雙縮脲的還原反應只在pH=10的情況下發(fā)生，故當Folin酚乙試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發(fā)生。由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度(相對于標準蛋白質(zhì))。

【實驗器材】

研缽、冰盒及玻棒、50 ml離心管、冷凍離心機、50 ml量筒、試管和試管架、移液器和槍頭、可見光分光光度計。

【藥品試劑】

1．小白菜。

2．濃度為0．25 mg/mL的標準蛋白質(zhì)溶液。

3．待測蛋白質(zhì)溶液。

4．Folin酚試劑甲:每次使用前，將50份(a)與1份(b)混合，即為試劑甲。

(a)將10 g Na₂CO₃、2 g NaOH和0．25 g酒石酸鉀鈉(NAC₄H₄O₆·4H₂O)溶解于蒸餾水中，然后定容到500 ml。

(b)0．5 g硫酸銅(CuSO₄·5H₂O)溶解于蒸餾水中，然后定容到100 ml。

5．Folin酚試劑乙:在2 L磨口回流瓶中，加入100 g鎢酸鈉(Na₂Wo₄·2H₂O)，25 g鉬酸鈉(Na₂MoO₄·2H₂O)及700 ml蒸餾水，再加50 ml 85%磷酸，100 ml濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入150 g硫酸鋰(Li₂SO₄)，50 ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴的步驟)。稀釋至1 L，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1 mol/L左右。

【實驗方法】

1．制備總蛋白樣品:稱取小白菜10 g，在研缽中碾成勻漿，加水10 ml后繼續(xù)碾10分鐘，倒入離心管中，另加20 ml水將研缽中的剩余物洗入離心管，5000 r/min離心10分鐘。取上清液10 ml定容到50 ml，此為待測蛋白質(zhì)樣品。

2．制備標準蛋白質(zhì)濃度曲線和測定待測樣品:標記試管，按表3-3依次向試管中加入各溶液，充分混勻。取玻璃比色杯，以0管作為零測定溶液在650 nm下的光吸收值。實驗需要精確控制操作時間，具體操作如下:在試管中加入終體積為1 ml的標準蛋白水溶液。第1支試管加入5 ml試劑甲后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入5 ml試劑甲，2分鐘后加第3支試管，以此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0．5 ml試劑乙，立刻混勻;1分鐘后第2支試管加入0．5 ml試劑乙，2分鐘后加第3支試管，以此類推。待最后一支試管加完試劑后，30℃放置20分鐘，然后開始測定650 nm光吸收。每分鐘測定一個樣品。

表3-3　　　　　　　Lowry法實驗設計表

3．數(shù)據(jù)處理:以蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)為橫坐標，光吸收值(A₂₈₀)為縱坐標做標準曲線。從標準曲線上查出稀釋后的樣品濃度，乘以稀釋倍數(shù)后計算樣品溶液的實際濃度，求三個稀釋倍數(shù)樣品的平均值。

【注意事項】

1．待測樣品1、2、3應為不同稀釋倍數(shù)，樣品量X1+水量Y1= 1 ml;

2．加入試劑甲或者試劑乙后，需立刻混勻，方能保證反應正常進行。

3．精確控制反應時間，保證每管反應時間一致。

【思考題】

1．簡述Folin酚法測蛋白質(zhì)含量的優(yōu)缺點。

2．Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量時有哪些注意事項?