一、生物強化

1.生物強化的概念與作用機理

生物強化，又稱生物增強，是通過向自然菌群中投加具有特殊作用的微生物來增強生物量，以強化生物對某一特定環(huán)境或特殊污染物的反應(yīng)，提高廢水處理系統(tǒng)的處理能力，從而達到去除某一種或某一類有害物質(zhì)的目的一種生物技術(shù)。

生物強化技術(shù)中投加的微生物可以是從自然界中篩選的優(yōu)勢菌種，來源于原有處理體系或其他自然環(huán)境，經(jīng)過馴化、富集、篩選、培養(yǎng)，從而達到一定數(shù)量的微生物，也可以是原來不存在的外源微生物甚至是通過遺傳工程技術(shù)產(chǎn)生的高效菌種。所投加的微生物應(yīng)滿足三個基本條件:①投加后，菌體活性高;②菌體可快速降解目標污染物;③在系統(tǒng)中不僅能競爭生存，而且可維持相當數(shù)量。

2.生物強化的作用機理

生物強化是通過向自然菌群中投加具有特殊作用的微生物來增強生物量，以強化系統(tǒng)對某一特定環(huán)境或特殊污染物的反應(yīng)。生物強化的作用機制主要是投加的高效微生物直接作用和微生物的共代謝作用。

(1)直接作用

直接作用是指投加的高效微生物直接以目標降解物質(zhì)為主要碳源和能源，使之分解轉(zhuǎn)化，從而加強生物處理系統(tǒng)對目標污染物質(zhì)的去除能力。首先將通過篩選、馴化、誘變、基因重組等技術(shù)得到的微生物(高效微生物)，經(jīng)培養(yǎng)增殖后投入處理系統(tǒng)。當原處理系統(tǒng)中沒有這種微生物時，投加的高效微生物可有針對性地去除目標降解物，如原處理系統(tǒng)中只有少量這種微生物時，投加高效微生物可大大縮短馴化微生物所需時間，提高去除能力。

(2)共代謝作用

微生物的共代謝作用是指只有在有初級能源物質(zhì)存在時，才能進行的有機化合物的生物降解過程。對于一些有毒有害物質(zhì)，微生物不能以其作為碳源和能源生長，但在其他基質(zhì)存在下能夠使原本不能利用的這些物質(zhì)得到降解。對于一些難降解的有機物如三氯乙烯(TCE)，以甲烷、芳香烴、氨、異戊二烯和丙烯為主要基質(zhì)生長的細菌并不能將其作為碳源和能源，但在利用這些原始底物(初級基質(zhì)，或共代謝基質(zhì))的代謝過程中，可以產(chǎn)生一種氧化酶共代謝三氯乙烯(TCE);Acenetbacter sp.的菌株生長在含有4-氯苯甲酸鹽的基質(zhì)上時，可以使原本不能利用的3，4-2氯苯甲酸鹽得以轉(zhuǎn)化。

許多難降解有機物的去除都是通過共代謝作用實現(xiàn)的。如在焦化廢水的處理中，投加生活污水能大大提高COD去除率，原因主要是生活污水中含有大量營養(yǎng)物質(zhì)，加強了微生物的共代謝作用。

共代謝能提高微生物對某些難降解有機物的去除效果，但機理十分復雜。微生物的共代謝包括:以易降解的有機物為碳源和能源，提高共代謝菌的生理活性;以目標污染物的降解產(chǎn)物作為酶的誘導物，促進酶的合成;不同微生物之間的協(xié)同作用等。

3.生物強化的技術(shù)路線

生物強化過程的實現(xiàn)大致包括菌種的分離篩選、馴化、培養(yǎng)及應(yīng)用。

首先是選擇分離源。分離源所處的環(huán)境應(yīng)有利于目標微生物的生長、存在較大數(shù)量。其次根據(jù)目標微生物對環(huán)境因子的要求設(shè)定選擇培養(yǎng)條件，馴化和培養(yǎng)目標微生物，最后將目標微生物投加到生物處理系統(tǒng)中。

誘變育種是最常用的微生物馴化方法，主要是通過誘變劑處理，使微生物發(fā)生變異。誘變處理首先是將細菌經(jīng)過功能篩選，挑選優(yōu)良的出發(fā)菌種;再將細菌菌株經(jīng)紫外線、亞硝酸、偶氮氨基氧化嘌呤或其他誘變劑處理，使基因突變;然后從經(jīng)處理的菌株中篩選具有所需特性且能在特定廢水中存活的變異菌株。篩選是在單一碳源培養(yǎng)基上連續(xù)進行，誘變劑量遞增以強化菌株特性，也可人為地提供特殊的強化環(huán)境來加速篩選過程。最后將篩選出的變異菌株在實驗室及現(xiàn)場進行應(yīng)用試驗，測試項目包括安全性、穩(wěn)定性及菌株繁殖能力等。

4.直接投加生物強化技術(shù)——直接投加特效降解微生物

生物強化技術(shù)主要包括直接投加生物強化技術(shù)和固定化生物強化技術(shù)，而直接投加生物強化技術(shù)又可分為直接投加特效降解微生物和直接投加共代謝基質(zhì)類物質(zhì)兩大類。

(1)直接投加特效降解微生物

生物強化技術(shù)應(yīng)用最為普遍的方式是直接投加對目標污染物具有特效降解能力的微生物，將這些特效微生物經(jīng)過篩選、培養(yǎng)、馴化之后，投入到污染環(huán)境中。投加微生物以目標污染物為唯一碳源和能源，投加的微生物可以附著在載體上，形成高效生物膜，也可以游離狀態(tài)存在，可以利用現(xiàn)成的生物強化制劑，有些甚至是借助專門的反應(yīng)器來完成的。

生物強化制劑是將從自然界中篩選出來的、有特定降解功能的微生物制成菌液制劑或?qū)⑵涓街邴滬煹容d體上制成干粉制劑。液態(tài)菌液微生物一般成活率較高，固態(tài)制劑使用前需用水溶成液態(tài)，細菌的成活率較液態(tài)菌液低，但更方便運輸和存儲。生物強化制劑具有很多優(yōu)點:縮短微生物培養(yǎng)馴化的時間，迅速提高生物處理系統(tǒng)中微生物的濃度，從而提高工作效率;使用安全，操作簡單方便，可以實時地處理污染。例如在處理下水道的油脂堵塞時，只需將細菌激活后加入到下水管道中，微生物很快在新的環(huán)境中占主導地位，開始侵蝕油脂類的有機顆粒，使管道中的阻塞物油脂塊脫落下來。

生物強化制劑的生產(chǎn)和使用主要步驟為:

①從自然環(huán)境中篩選、分離、純化特效微生物或通過遺傳工程手段獲取特效微生物;

②擴大培養(yǎng);

③制成液體或干粉活菌制劑:將具有特定降解功能的微生物制成菌液制劑或?qū)⑵涓街邴滬熒现瞥筛煞壑苿?

④向生物處理系統(tǒng)投加。一般在投加前需先將微生物激活。

目前，直接投加高效微生物生物強化技術(shù)已成功地應(yīng)用于難降解廢水處理、有機垃圾、污泥堆肥處理以及污染土壤的生物修復等方面，大大提高了有機物降解轉(zhuǎn)化速度和處理效果。

如在紙漿和造紙廢水中含有樹脂酸，對水生生物具有毒性。直接投加特效降解微生物——樹脂酸降解菌大大提高了對樹脂酸的去除率。

焦化廢水是成分極其復雜的難處理廢水，含有酚類、其他單環(huán)及多環(huán)的芳香族化合物及含氮、硫、氧的雜環(huán)化合物。對焦化廢水中特殊污染成分的降解最有效的是投加特效微生物，如苯酚降解菌、萘降解菌和吡啶降解菌等，可以降解廢水中的特殊污染物，投加苯酚降解菌Pseudomonas protida ATCC11172可使苯酚的去除率一直保持在95%～100%，而沒有進行生物強化的對照組，苯酚的去除率開始很高，但很快降到40%左右。

印染廢水中含有大量難降解的有機染料，使用傳統(tǒng)生物處理技術(shù)對印染廢水色度的去除效果很不理想，通過投加特效優(yōu)勢菌，可取得較好脫色效果，并能保持處理效果的穩(wěn)定性。如一嗜熱鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium thalpopilum)菌株在5天內(nèi)對派拉丁藍的脫色率就達到34%。目前，投菌法對16偶氮染料、蒽醌染料的脫色處理方面都有良好效果，系統(tǒng)脫色率可穩(wěn)定在90%以上。常用的脫色優(yōu)勢菌有假單胞菌、氣單胞菌和紅螺菌等，可從廢水處理污泥中篩選、分離、馴化，也可以是遺傳工程菌，實踐中也可使用混合特效菌群，脫色效果有時比純菌株好。

投加高效復合微生物菌群可以使堆層中的微生物迅速繁殖，并維持在相對穩(wěn)定的較高水平上，加速生活垃圾和污泥的降解。利用生活垃圾和污泥作為原材料，接種高效復合微生物菌群進行堆肥，是固體廢物資源化的一條有效途徑。

直接投加生物強化技術(shù)同時也是生物修復的重要手段，常用于污染水體、污染土壤的原位生物修復中。投加的微生物大多使用土著微生物，一方面是由于土著微生物降解污染物的巨大潛力，另一方面是接種的微生物在環(huán)境中難以保持較高的活性;此外因工程菌的生態(tài)安全性等原因，使其在工程應(yīng)用中受到了嚴格的限制。當受污染環(huán)境中合適的土著微生物生長過慢，代謝活性不高，或者由于污染物毒性過高造成微生物數(shù)量反而下降時，可以人為地接入外源的適宜的污染降解高效菌，同時提供這些微生物生長所需的營養(yǎng)。

構(gòu)建外源和土著微生物的耦合系統(tǒng)往往比簡單投加單一菌種更有效。張甲耀等以三環(huán)芳烴蒽為模式污染物，根系發(fā)達的經(jīng)濟作物黃麻為模式植物，把蒽高效降解菌和生物表面活性劑產(chǎn)生菌銅綠假單胞菌(Pseudomonas aerugiosa)作為根際微生物耦合系統(tǒng)的構(gòu)建菌，與黃麻根際優(yōu)勢菌進行原生質(zhì)體電融合，形成既產(chǎn)生表面活性劑和對蒽具有高效降解能力且能在根際旺盛生長的耦合系統(tǒng)，將所得到的融合子定殖回黃麻根際，可高效修復蒽污染土壤。

(2)投加生物共代謝基質(zhì)及輔助營養(yǎng)物質(zhì)

實踐中可利用生物的共代謝作用來強化生物處理。由于許多難降解有機污染物的降解是通過共代謝途徑實現(xiàn)的，且在常規(guī)生物處理系統(tǒng)中能降解這些目標污染物的微生物活性低、數(shù)量少，因此，在反應(yīng)體系中投加碳源、能源營養(yǎng)物質(zhì)，或目標污染物降解過程中所需的因子，將有助于降解微生物的生長?；|(zhì)類似物(誘導物)是目標污染物的降解產(chǎn)物、前體，可以作為酶的誘導物，提高酶的活性。

投加共代謝初級基質(zhì)能強化系統(tǒng)對難降解污染物質(zhì)的處理能力。在投加初級基質(zhì)的情況下，微生物可以利用初級基質(zhì)為碳源和能源，同時氧化原來不能利用的二級基質(zhì)，從而改善處理系統(tǒng)的性能。對于一些難降解的有機污染物(二級基質(zhì))，微生物并不以其為碳源，而以甲烷、丙烷、甲苯、酚、氨和二氯苯氧基乙酸等為原始底物(初級基質(zhì))，但微生物在利用這些初級基質(zhì)作為碳源的過程中，能產(chǎn)生一些化學物質(zhì)等改變了目標污染物的結(jié)構(gòu)，使得原本不能利用的二級基質(zhì)能被微生物降解。

微生物以其他底物為碳源，形成可以改變目標污染物結(jié)構(gòu)的氧化酶，需要Fe³⁺或Mg²⁺來傳遞電子，在廢水中加入這些離子可以提高污染物的降解速率。

投加電子受體和輔助營養(yǎng)物質(zhì)，如微生物生長所需的微量元素、維生素、有機酸等成分，也有助于提高系統(tǒng)的處理能力。

有時也同時使用高效菌種和共代謝初級基質(zhì)組合協(xié)同作用來強化處理系統(tǒng)。有人研究了生物共代謝對焦化廢水生物處理的增強作用，同時研究了高效菌種和共代謝初級基質(zhì)組合協(xié)同作用的效果。結(jié)果表明，投加共代謝初期基質(zhì)、Fe³⁺和高效菌種，均能促進難降解有機物的降解，提高焦化廢水COD去除率，當三者協(xié)同作用時，效果更好。

5.固定化生物強化技術(shù)

直接投菌法雖然簡單易行，但是所投加的特效微生物容易流失，或易被其他微生物吞噬。固定化技術(shù)是將單一或混合的優(yōu)勢菌株固定封閉在特定的載體上，例如將特定的微生物封閉在高分子網(wǎng)絡(luò)載體內(nèi)，使菌體脫落少、活性高，從而提高優(yōu)勢微生物濃度，延長其在生物處理器中的存留時間。

固定化生物強化(主要是固定化酶、固定化微生物)技術(shù)是20世紀60年代發(fā)展起來的一門新興生物技術(shù)。該技術(shù)利用物理或化學的手段將游離微生物細胞或酶定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持活性反復利用，具有效率高、穩(wěn)定性強、反應(yīng)易控制、對環(huán)境耐受能力強、保持菌種高效等優(yōu)點。目前，固定化生物強化技術(shù)已由原來的單一固定化酶、固定化微生物細胞發(fā)展到聯(lián)合固定化(co-immobilization)，如酶與微生物細胞、好氧微生物與厭氧微生物的聯(lián)合固定。

(1)常用的固定化方法

常用的微生物固定化方法主要有:包埋法、交聯(lián)法、載體結(jié)合法、系統(tǒng)截留法。

固定化細胞載體主要分兩類:①天然高分子凝膠載體，常用的是瓊脂、海藻酸鈣等;②有機合成高分子凝膠載體，如聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺(PAM)等。高效的固定化細胞載體應(yīng)滿足以下條件:①傳質(zhì)性能好，廢水較容易接觸包埋在其中的微生物;②強度好，不易破碎;③對微生物沒有毒害作用;④性質(zhì)穩(wěn)定，不易被生物分解，壽命長且價格低。

1)包埋法。包埋法操作簡單，對細胞活性影響小，固定化細胞強度高，是應(yīng)用最廣泛的固定化方法。包埋法是利用線性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物載體的包裹作用，將游離細胞載留在高分子材料內(nèi)，其結(jié)構(gòu)可防止細胞滲出到周圍培養(yǎng)基中，但底物仍能滲入與細胞發(fā)生反應(yīng)。

常用的包埋法有懸滴成球法及冷凍法。常用的包埋載體有瓊脂、海藻酸鈣等天然高分子凝膠及聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺(ACAM)等有機合成高分子凝膠。包埋法操作簡單，對細胞活性影響小，但目前包埋的固定化細胞使用壽命不長，從而限制了它的工業(yè)化應(yīng)用。

包埋優(yōu)勢菌比游離優(yōu)勢菌降解效率高。包埋對高效微生物提供了臨時保護的作用，防止被其他微生物如原生動物捕食，同時幫助外來細菌黏附在絮凝體中，提高了高效菌的降解速率，同時可提高處理效率和耐溫沖擊性，同時微生物活力及穩(wěn)定性均保持較好。

2)交聯(lián)法。交聯(lián)法又稱無載體固定化法。該法不用載體，微生物細胞直接與兩個以上官能團的試劑進行交聯(lián)反應(yīng)固定，試劑的官能團以共價鍵方式為細胞之間架橋，形成三維網(wǎng)絡(luò)狀絮體。由于酶蛋白的官能團參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心結(jié)構(gòu)可能受到影響而使酶顯著失活。此外，交聯(lián)劑如戊二醛等價格昂貴，限制了其應(yīng)用。

3)載體結(jié)合法。又稱吸附法，通過物理吸附、離子結(jié)合、共價結(jié)合及生物特異吸附等作用將生物催化劑(酶)固定在不溶性載體上。這種方法操作簡單，對微生物活性影響小，但所結(jié)合的微生物量有限，反應(yīng)穩(wěn)定性和反復使用性差。美國賓州大學培養(yǎng)從活性污泥中分離出的優(yōu)勢菌絲孢酵母(Frichosporon cutaneum)和假單胞菌(Pseudomona sp)，提取高酶活性的酚氧化酶，再以化學手段結(jié)合到玻璃珠上，用于處理冶金工業(yè)含酚廢水，使固定酶活性可達游離細胞的90%。

4)系統(tǒng)截留法。該方法利用各種半透膜(如滲析膜、超濾膜、反滲透膜、中空纖維等)將生物催化劑限定在一定的空間范圍內(nèi)，或?qū)⑦^濾、離心、沉淀后的生物催化劑返回到生物反應(yīng)器中循環(huán)使用。其中，中空纖維膜(hollow fiber membrane)生化反應(yīng)器最有實用價值。

(2)固定化技術(shù)在實踐中的應(yīng)用

固定化生物強化技術(shù)能大大提高難降解物質(zhì)的處理效率，目前已成功地應(yīng)用于廢水、廢氣處理等方面，如固定化脫色菌群處理印染廢水可提高印染廢水脫色率;化工、焦化廢水中的酚、氰等有毒化學物質(zhì)，用固定化微生物方法處理具有耐毒性且處理效率高;將硝化細菌和反硝化細菌分別包埋，用于廢水脫氮可提高脫氮效率。用固定化酶和固定化微生物處理廢氣中的惡臭含硫污染物和揮發(fā)性有機污染物均取得了可喜成果。

廢水處理實踐中，由于廢水組成復雜而且經(jīng)常變化，利用單一的固定化酶很難收到好的處理效果，只有利用多種固定化酶組合處理，才能使有機物完全無機化和穩(wěn)定化。微生物本身就是多酶體系的載體，如果把對多種污染物降解能力強的多種微生物固定在同一載體上，無疑會大大提高處理效率。

雖然固定化酶與固定化微生物在處理效果上有明顯的優(yōu)越性，但由于這種技術(shù)處理廢水成本高，且固定化酶活性半衰期為20天，使用壽命較短，機械強度也較差，且酶柱和酶布上易長雜菌，這些都制約著固定化酶和固定化微生物這一新技術(shù)的推廣和應(yīng)用?；谏鲜鲈?，固定化酶和固定化微生物技術(shù)可以在小水量的特種工業(yè)廢水中應(yīng)用。

值得注意的是，并非所有固定化的微生物都優(yōu)越于游離態(tài)的微生物。固定化微生物受其自身傳質(zhì)性能和傳氧性能的影響，特效微生物和目標污染物的接觸受到阻礙，從而影響污染物的降解效率。而游離態(tài)的混合菌液投加到反應(yīng)器中之后，能迅速得到混合、擴散、分布，沒有傳質(zhì)阻力。