細(xì)胞內(nèi)的折疊或組裝出現(xiàn)錯(cuò)誤的、變性的、受到損傷的、正常的、外來的蛋白質(zhì)分子會被迅速降解，這些蛋白質(zhì)分子的降解可以發(fā)生在溶酶體內(nèi)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中或細(xì)胞液中。人類細(xì)胞中存在兩類細(xì)胞降解途徑，即溶酶體和泛素-蛋白酶體通路，前者無需能量，主要降解細(xì)胞外和細(xì)胞膜蛋白質(zhì)；后者則是一種消耗能量的高效、特異的蛋白質(zhì)降解過程控制著細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解。

（一）溶酶體

溶酶體是在1955年由Christian De Duve發(fā)現(xiàn)的，是真核細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為單層膜包被的囊狀結(jié)構(gòu)，直徑為0．025～0．8μm，內(nèi)含多種水解酶，可水解蛋白質(zhì)、多糖、脂類等內(nèi)源性生物大分子。

除成熟紅細(xì)胞外，哺乳類動物各種細(xì)胞都含有溶酶體。溶酶體內(nèi)含50余種酸性水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、磷酸酶、糖苷酶、脂肪酶磷酸酯酶和硫酸酯酶等。溶酶體的酶有3個(gè)特點(diǎn)：①因?yàn)槿苊阁w膜蛋白多為糖蛋白，所以溶酶體膜內(nèi)表面帶負(fù)電荷，這樣有利于溶酶體總的酶保持游離狀態(tài)，并能保證其行使正常功能和防止細(xì)胞自身被消化；②溶酶體膜內(nèi)保持低pH狀態(tài)，有利于保持水解酶活性（溶酶體內(nèi)pH約5．0，周圍胞質(zhì)pH約7．2），這依賴于溶酶體膜內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白可利用ATP水解的能量將胞質(zhì)中的H＋泵入溶酶體，從而維持溶酶體內(nèi)低pH狀態(tài)；③底物只有進(jìn)入溶酶體才能被水解，不過如果溶酶體膜破損，水解酶逸出，細(xì)胞就會自溶。

溶酶體具有多種生理功能，包括原生動物借助溶酶體消化攝入的食物，真核細(xì)胞器更新，以及動物發(fā)育和變態(tài)過程中組織的退化（如蝌蚪尾巴的吸收）等，另外，在白細(xì)胞中，溶酶體性質(zhì)的顆粒還能消滅入侵的微生物。溶酶體內(nèi)水解酶對機(jī)體很多物質(zhì)的代謝密切相關(guān)，如果由于基因缺陷等原因可造成溶酶體內(nèi)相應(yīng)水解酶缺乏，其特異底物不能被水解而蓄積在溶酶體，造成細(xì)胞代謝障礙，形成溶酶體儲（貯）積病。在某些臟器，如果細(xì)胞攝入過多或因溶酶體酶活性降低而在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量溶酶體過載，也會引起該病，如Ⅱ型糖原儲（貯）積病。溶酶體功能失常還與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腦卒中和老年癡呆癥有關(guān)。

（二）泛素-蛋白酶體在蛋白質(zhì)降解中的作用

泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解通路是蛋白質(zhì)功能的主要調(diào)節(jié)者和終結(jié)者。泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解這一重大發(fā)現(xiàn)最關(guān)鍵的基礎(chǔ)是降解本身需要能量。泛素研究的歷史可追溯到20世紀(jì)40年代，Rudolph Schoenheimer發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)處于不斷地產(chǎn)生和分解的動態(tài)平衡中。1953年，Simpson利用放射性核素進(jìn)行代謝實(shí)驗(yàn)，揭示了生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)的降解需要ATP水解，但當(dāng)時(shí)認(rèn)為水解反應(yīng)是釋放能量的反應(yīng)，他認(rèn)為ATP釋放的能量不可能直接用于蛋白質(zhì)降解，隨后Schneider發(fā)現(xiàn)，ATP是維持溶酶體的低pH所必需的，然而選擇性抑制溶酶體活性只能抑制由營養(yǎng)缺乏等因素引起的蛋白質(zhì)降解，而對正常代謝條件下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解無影響。直至1977年Goldberg通過網(wǎng)織紅細(xì)胞向紅細(xì)胞最終分化時(shí)，溶酶體消失，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)仍快速降解，首次證明了蛋白質(zhì)降解本身是直接需要能量的過程，人類細(xì)胞中存在可溶的，直接依賴能量的非溶酶體類蛋白酶。此后，Hershko、Ciechanover和Rose及其他們的同事很快就證明了泛素即為蛋白降解酶的活化因子，提出有關(guān)泛素在蛋白質(zhì)降解中作用的“泛素假說”。1983年，Goldberg證明泛素修飾后的蛋白質(zhì)降解仍然需要ATP，提出“在蛋白質(zhì)降解的過程中ATP依賴的二段假說”，他們的研究導(dǎo)致了現(xiàn)在被稱為“蛋白酶體”（proteasome）的ATP依賴性蛋白降解酶的發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）已成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)之一。

1．泛素與泛素化 泛素是含有76個(gè)氨基酸殘基的低分子量蛋白質(zhì)（MW 8．6ku，pI 6．7），因其廣泛存在于各種真核細(xì)胞而得名。泛素的氨基酸序列非常保守，人與酵母的泛素只有3個(gè)氨基酸殘基的差異，具有很好的熱穩(wěn)定性。X射線衍射分析顯示，泛素是一個(gè)緊密的球形結(jié)構(gòu)，包括4個(gè)β片層和一個(gè)α螺旋，形成3個(gè)半轉(zhuǎn)角。泛素通常以兩種形式存在：一種是游離形式；另一種是通過其C端與受體蛋白賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基酸基團(tuán)共價(jià)連接。

參與泛素-蛋白酶體通路介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解過程需要3個(gè)酶：一是泛素活化酶（ubiqutin-activating enzyme，E1）是催化泛素與蛋白質(zhì)底物結(jié)合所需的第一個(gè)酶，能水解ATP，通過其活性位置的半胱氨酸殘基在泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素，E1在細(xì)胞內(nèi)含量較豐富，是細(xì)胞生存必需的，進(jìn)化很保守。二是泛素載體蛋白（ubiqutin-carrier protein or ubiqutinconjugating enzyme，E2）是催化泛素與蛋白質(zhì)底物結(jié)合所需的第二個(gè)酶，在泛素和底物蛋白之間催化形成異肽鍵（Iso-piptide）。E2是1985年首先從網(wǎng)織紅細(xì)胞中分離純化的，細(xì)胞內(nèi)有多種E2，它們的分子質(zhì)量差異很大，但介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的多是小分子E2，真核細(xì)胞小分子E2一級結(jié)構(gòu)很保守，都含有一個(gè)約160個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的UBC結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域含有其發(fā)揮活性必需的半胱氨酸殘基，這一半胱氨酸殘基在泛素-E2酶硫酯鍵形成中起作用。三是泛素連接酶（ubiqutin-protein ligase，E3），它是泛素與蛋白質(zhì)底物結(jié)合的第3個(gè)酶，在決定泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解的選擇性上具有重要意義，它直接與底物或通過輔助蛋白與底物相互作用。細(xì)胞內(nèi)至少存在幾百種E3，各種E3缺乏序列同源性，組成相差很大，有的是單體蛋白，有的是多亞基復(fù)合體。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞的E3主要有3類：即含HECT（homologous to E6-APC-terminal）結(jié)構(gòu)域的E3、含環(huán)指結(jié)構(gòu)（RING finger）的E3和含U-box結(jié)構(gòu)域的E3。

泛素化過程是泛素與蛋白質(zhì)底物結(jié)合的化學(xué)過程，由上述3個(gè)酶催化完成：①泛素活化酶催化泛素C末端的甘氨酸（Gly），形成Ub-腺苷酸中間產(chǎn)物，然后激活的泛素C端被轉(zhuǎn)移至E1酶內(nèi)的半胱氨酸（Cys）殘基的—SH上。②活化的泛素通過轉(zhuǎn)酰基作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到泛素載體蛋白上特異的半胱氨酸殘基上，形成E2-Ub硫酯；E2-Ub硫酯提供泛素分子以供泛素C端甘氨酸與底物蛋白的Lys殘基的氨基形成共價(jià)鍵，第一個(gè)泛素單體是與底物蛋白內(nèi)部的Lys殘基的ε氨基或與底物的α氨基結(jié)合，形成異肽鏈的旁鏈連接或線性肽鍵。③泛素可以直接從E2轉(zhuǎn)移給底物蛋白（S）形成Ub-蛋白復(fù)合物，或底物蛋白（S）首先與泛素連接酶結(jié)合，然后底物蛋白與E2轉(zhuǎn)移的泛素結(jié)合。最終Ub-蛋白復(fù)合物主要被26S的蛋白酶體識別降解。泛素C末端水解酶可通過水解釋放Ub以供再一次循環(huán)利用。圖7-11示泛素化過程。

泛素蛋白參與許多重要的細(xì)胞過程，如蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、降解過程，DNA的修復(fù)，細(xì)胞分裂、吞噬以及凋亡等過程。泛素通過賴氨酸側(cè)鏈與目標(biāo)蛋白形成復(fù)合物，而這些泛素分子上暴露的賴氨酸殘基則反過來又作為修飾位點(diǎn)，在目標(biāo)蛋白上形成多個(gè)泛素鏈。泛素化過程中的細(xì)胞內(nèi)信號特異性至少有一部分是由這種泛素鏈的長度和連接類型決定的。一般認(rèn)為，由48位或29位賴氨酸連接的4個(gè)或更多個(gè)泛素鏈參與26S蛋白酶體途徑的蛋白質(zhì)降解過程，而由63位賴氨酸殘基連接的泛素鏈則不參與蛋白質(zhì)的降解過程，它主要參與各種下游事件，如DNA修復(fù)的后復(fù)制過程、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、內(nèi)吞過程以及一些核糖體的功能等。

圖7-11　泛素化過程

同時(shí)，在泛素化過程中，也有一些在三維結(jié)構(gòu)上與泛素相似的其他調(diào)控蛋白，稱之為類泛素蛋白，修飾底物發(fā)生類泛素化，參與調(diào)控一些重要的細(xì)胞過程，如以P53等為修飾底物的NEED8／Rub1，與泛素同源性為58%，可發(fā)揮正向調(diào)控泛素連接酶E3的活性；引導(dǎo)底物蛋白酶體降解等生物學(xué)功能。

2．泛素結(jié)合蛋白 能夠與泛素結(jié)合的蛋白質(zhì)為泛素結(jié)合蛋白。目前研究發(fā)現(xiàn)主要有八種類型的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如UBA、UIM、CUE、GAT、UEV、NZF和PAZ等，長度在20～150個(gè)氨基酸之間。泛素結(jié)合蛋白通過結(jié)合泛素，或傳遞蛋白質(zhì)上的泛素化信號，或促進(jìn)泛素的結(jié)合或解聚。這些結(jié)構(gòu)域能夠特異性結(jié)合單個(gè)泛素分子、多聚泛素鏈或泛素化底物。目前主要通過生物信息學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物物理學(xué)等手段，鑒定和分析這些泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

3．去泛素化 細(xì)胞內(nèi)的許多重要的過程均由靶蛋白泛素化來調(diào)控，然而，去泛素化酶催化的去泛素化在調(diào)節(jié)許多生化途徑中也起著重要的作用，如增強(qiáng)許多關(guān)鍵調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性。雖然泛素與細(xì)胞內(nèi)許多被快速降解的蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵相結(jié)合，但泛素是一種非常穩(wěn)定的蛋白，這是由于泛素在泛素化蛋白被降解之前，就已被蛋白去泛素化酶水解脫離下來，避免一起被降解，解離下來的泛素可被循環(huán)利用。蛋白質(zhì)去泛素化的重要性還在于一種蛋白質(zhì)在被確定將被蛋白酶體或溶酶體降解之前，可通過去泛素化避免被不必要地或錯(cuò)誤地降解。

4．泛素-蛋白酶體通路 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解是一個(gè)高度復(fù)雜、受到嚴(yán)格調(diào)控的生命過程，而不能簡單地將其視為一個(gè)非特異的蛋白質(zhì)的終結(jié)過程，其生物學(xué)意義也遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)合成更為復(fù)雜。真核生物中，通過胞吞或胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞外蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分別由兩條不同的途徑降解：如凝血因子、免疫球蛋白、白蛋白、載體蛋白、激素等胞外蛋白質(zhì)被細(xì)胞攝入后可形成內(nèi)體，與溶酶體融合后降解，此溶酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解是非特異的，針對不同蛋白質(zhì)的降解速率基本不變；而絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解是經(jīng)泛素-蛋白酶體通路（ubiquintin-proteasome pathway）完成的，該降解途徑具有特異性、高效性和不可逆的特點(diǎn)，并受多種調(diào)節(jié)機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控。經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解的蛋白質(zhì)的半衰期可以很長，如細(xì)胞骨架蛋白半衰期幾天、晶狀體蛋白半衰期幾年，也可以很短，如p53半衰期僅幾分鐘。目前發(fā)現(xiàn)，許多參與細(xì)胞周期、細(xì)胞程序性死亡以及感染等重要信號途徑的調(diào)節(jié)蛋白本身均受蛋白酶體降解調(diào)控。此外，細(xì)胞內(nèi)新合成的、具有缺陷的蛋白質(zhì)以及變性蛋白也會被蛋白酶體迅速降解，以防止錯(cuò)誤折疊和受損蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)積聚。在細(xì)胞受到外界刺激或者由于自身生長導(dǎo)致細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變時(shí)，蛋白酶體介導(dǎo)的迅速且不可逆的特異性蛋白質(zhì)降解成為細(xì)胞打破舊的胞內(nèi)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)秩序，建立新秩序的基礎(chǔ)。

蛋白酶體廣泛分布于真核細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)，負(fù)責(zé)著細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解，因而調(diào)控著幾乎所有的細(xì)胞活動。它是一種巨大的（約2 000ku）、具有多種蛋白水解酶活性的、主要依賴于泛素的、由幾十個(gè)亞基組成的、具有四級結(jié)構(gòu)的復(fù)合蛋白酶。其空間結(jié)構(gòu)將蛋白質(zhì)水解活性位點(diǎn)封閉在一個(gè)桶形的空腔中，僅通過狹窄的門控通道與外界相連，從而有效阻止正常折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)入降解腔。26S蛋白酶體由20S核心復(fù)合物（core particle，CP）和19S調(diào)節(jié)復(fù)合物（regulatory particle，RP，也稱PA700）組成。20S核心復(fù)合物約700ku，由4個(gè)同軸的、7個(gè)亞基組成的七聚體環(huán)形壘疊，形成中空的桶狀結(jié)構(gòu)。位于桶狀結(jié)構(gòu)外側(cè)的兩個(gè)環(huán)（α環(huán)）由α亞基（α1～7）組成；位于桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè)的兩個(gè)環(huán)（β環(huán)）由β亞基（β1～7）組成。19S調(diào)節(jié)復(fù)合物是20S核心復(fù)合物最主要的激活物，在降解過程中19S調(diào)節(jié)復(fù)合物的功能是：①底物識別；②降解底物去折疊；③釋放游離的泛素分子，即去泛素化；④打開α環(huán)上的降解腔通道；⑤將去折疊底物送入降解腔。泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解途徑是：泛素分子在泛素活化酶、泛素載體蛋白和泛素連接酶的順序催化下交聯(lián)到特異性降解底物的一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基上，形成長短不一的Ub鏈，成為可被蛋白酶體識別的降解信號；泛素化的底物被蛋白酶體19S亞基識別后與蛋白酶體復(fù)合物結(jié)合；蛋白去折疊后通過α環(huán)上的狹窄通道轉(zhuǎn)運(yùn)至20S蛋白水解腔中降解，同時(shí)釋放出游離的泛素分子。泛素化酶系和蛋白酶體復(fù)合物既可以定位于胞質(zhì)，也可以定位于胞核，從酵母到哺乳動物細(xì)胞，這種嚴(yán)格的泛素化調(diào)控機(jī)制是高度保守的。