傳統(tǒng)的PCR（標(biāo)準(zhǔn)PCR）通常只能擴增2～3kb以內(nèi)的短片段，對5kb以上的長片段很難有效擴增。限制其擴增長片段的主要原因是：①因Taq　DNA聚合酶缺少3＇→5＇核酸外切酶活性，有較高的錯誤摻入率，而合成4．1kb核苷酸可能導(dǎo)致1次框碼移位，在產(chǎn)物鏈3＇端出現(xiàn)錯配堿基，促使鏈合成提前終止；②Tris緩沖液在溫度升高時，pH降低，誘發(fā)脫嘌呤反應(yīng)，使模板受損，導(dǎo)致長片段無法合成；③Taq　DNA聚合酶在PCR過程中活力下降；④非特異性擴增干擾長片段的延伸。近年來發(fā)展起來的長片段PCR（long　PCR）技術(shù)，針對上述限制因素將PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了改良。已從人類基因組和λ噬菌體DNA中，成功地擴增出29．9kb和42kbDNA片段，有望成為一項實驗室的常規(guī)方法。

1．模板　采用瓊脂糖包埋細(xì)胞抽提法，獲取高質(zhì)量的模板DNA，以保證模板的完整性。

2．引物　應(yīng)設(shè)計較長的引物，一般為21～34個核苷酸，可以使用較高的退火溫度，減少錯誤引發(fā)，兩個引物的解鏈溫度應(yīng)平衡，差別最好不要超過1℃。

3．酶　具有3＇→5＇外切酶活性（校正閱讀功能）的DNA聚合酶可糾正復(fù)制時的錯配，有利于長片段的延伸，但也存在破壞引物和單鏈模板的可能性。改良的方法是將無3＇→5＇外切酶活性的DNA聚合酶（如rTth）和低濃度有3＇→5＇外切酶活性的DNA聚合酶（如Pfu）組合使用。近來已采用酶的不同組合方式，實現(xiàn)了多種目的DNA的長片段擴增。其中以rTth與vent或Pfu組合效果最好，能夠擴增出＞5kb的DNA片段。

4．緩沖液　長片段PCR反應(yīng)體系通過提高Tris的濃度，或改用Tricine緩沖液以增強緩沖能力，并上調(diào)體系的pH，起始控制在pH　8．8～9．2，使隨溫度上升而降低的pH得到補償。另外，在體系中加入一定量的甘油、EDTA、Tween20、聚乙二醇、DMSO、明膠等，以降低模板解鏈溫度和（或）提高DNA聚合酶的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)長片段的擴增。

5．熱循環(huán)參數(shù)　增加延伸時間，一般為1kb／min。提高退火溫度，同時采用熱啟動，以減少引物錯配及引物二聚體的形成，增加擴增的特異性和產(chǎn)物量。熱循環(huán)后期，每個循環(huán)適當(dāng)增加延伸階段的時間，如在28～40個循環(huán)的后12～20個循環(huán)中，每次增加15～30s，以保證產(chǎn)物鏈充分延伸。