（一）清除標(biāo)準(zhǔn)

（1）可有效清除殘余消毒劑。

（2）對(duì)試驗(yàn)微生物無(wú)害，不影響受損傷微生物的復(fù)蘇。

（3）不影響載體上微生物洗脫，不減少細(xì)菌回收量。

（4）對(duì)培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分不產(chǎn)生拮抗作用，不影響液體培養(yǎng)液的透明度。

（5）病毒滅活試驗(yàn)用中和劑對(duì)培養(yǎng)病毒的細(xì)胞無(wú)害，不破壞細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液的成分。

（6）不干擾細(xì)菌和病毒檢測(cè)方法的靈敏度。

（二）化學(xué)中和法清除試驗(yàn)

【試驗(yàn)準(zhǔn)備】

準(zhǔn)備好所需中和劑和其他培養(yǎng)液、試劑，以及無(wú)菌器材。設(shè)計(jì)試驗(yàn)組及其作用見表29-3。

【操作步驟】

1.懸液定量法中和劑試驗(yàn)

（1）全部試驗(yàn)：應(yīng)在18～22℃之間進(jìn)行。

（2）第1組：先在消毒劑試管內(nèi)加入菌懸液立即混勻，作用到規(guī)定時(shí)間取0.5ml菌藥混合液加于4.5ml稀釋液試管內(nèi)，取樣做傾注接種到無(wú)菌平皿內(nèi)。

（3）第2組：吸取菌懸液加到消毒劑試管內(nèi)立即混勻，作用到規(guī)定時(shí)間取0.5ml加到4.5中和劑試管內(nèi)混勻，中和作用10min后按上述程序取樣接種。

（4）第3組：吸取菌懸液加到中和劑試管內(nèi)混勻，中和作用10min，吸取0.5ml加到4.5ml中和劑試管內(nèi)，如此連續(xù)進(jìn)行10倍稀釋，一般稀釋10－3～10－4（原液含菌量約為105～106），取最后稀釋度進(jìn)行傾注接種。

（5）第4組：取消毒劑加到中和劑試管內(nèi)混勻，中和作用10min后，然后加入菌懸液混勻，作用10min，再用中和劑同第3組一樣進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋，然后取樣接種。

（6）第5組：吸取菌懸液加到稀釋液試管內(nèi)混勻，作用10min后，用稀釋液進(jìn)行連續(xù)稀釋，然后取適當(dāng)稀釋度樣接種。

（7）第6組：取無(wú)菌稀釋液和中和劑接種到所用培養(yǎng)液內(nèi)，做陰性對(duì)照組。

（8）將接種好的平皿倒入熔化冷卻到45～50℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液混勻，冷卻凝固后，反轉(zhuǎn)置于37℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24～48h，記錄各平板菌落形成單位，計(jì)算出各組菌數(shù)（cfu／ml），以此來(lái)判斷中和劑中和效果。

2.載體定量法中和劑試驗(yàn)　與懸液定量試驗(yàn)一致，只是在每組因子組合中以菌片代替菌懸液即可，以菌片轉(zhuǎn)移代替液樣轉(zhuǎn)移。

【結(jié)果評(píng)定】

判定中和劑有效必須滿足如下條件：第1組無(wú)菌生長(zhǎng)或僅有少量細(xì)菌生長(zhǎng)；第2組有菌生長(zhǎng)并且比第1組菌數(shù)明顯地多，但第2組計(jì)算殺菌率符合消毒劑最低有效濃度要求；第3、4、5組生長(zhǎng)菌數(shù)接近并符合染菌量要求，各組間誤差≤15%；第6組無(wú)菌生長(zhǎng)；試驗(yàn)連續(xù)重復(fù)3次結(jié)果一致。滿足上述條件，可以判定中和劑符合標(biāo)準(zhǔn)。各組試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際意義詳見表29-1。

【注意事項(xiàng)】

1.設(shè)計(jì)完整　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的各組要觀察齊全，不得遺漏。各種試驗(yàn)條件應(yīng)與實(shí)際殺菌試驗(yàn)一致。

2.進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)　做好預(yù)備試驗(yàn)，選擇好最低有效濃度和作用時(shí)間，準(zhǔn)確掌握菌懸液濃度以便確定稀釋度。

3.確定試驗(yàn)有效性　對(duì)于難以選出中和劑的復(fù)方消毒劑或中草藥消毒劑，可采用血平板必要時(shí)采用動(dòng)物接種法來(lái)確定是抑菌還是殺菌。

表29-1　中和劑效果鑒定實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)及其意義

（三）病毒滅活中和劑鑒定預(yù)備試驗(yàn)

在我國(guó)現(xiàn)行版《消毒技術(shù)規(guī)范》中涉及到病毒滅活檢驗(yàn)主要用細(xì)胞培養(yǎng)法，指標(biāo)病毒用脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型疫苗株（Polio-Ⅰ）。

【設(shè)計(jì)】

（1）中和劑＋細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)（觀察中和劑對(duì)細(xì)胞的影響）。

（2）消毒劑＋中和劑＋細(xì)胞（觀察中和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的影響）。

（3）消毒劑＋細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)（觀察消毒劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響最低濃度）。

【操作步驟】

第1組：將試驗(yàn)用細(xì)胞分別加入不同稀釋度的中和劑中，3～4h后吸出液體，再加入細(xì)胞維持液，置于37℃二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

第2組：將試驗(yàn)用細(xì)胞分別加入不同稀釋度的中和產(chǎn)物中，3～4h后吸出液體，再加入細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置于37℃二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

第3組：將試驗(yàn)用細(xì)胞分別加入不同稀釋度的消毒劑中，3～4h后吸出殘余消毒劑，再加入細(xì)胞維持液，置于37℃二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

【結(jié)果判斷】

第1，2組細(xì)胞生長(zhǎng)正常，第3組以細(xì)胞生長(zhǎng)正常的消毒劑最高濃度組帶入正式試驗(yàn)。

（四）病毒滅活中和劑鑒定正式試驗(yàn)

【設(shè)計(jì)】

（1）消毒劑＋病毒，作用后接種細(xì)胞培養(yǎng)。

（2）消毒劑＋病毒＋中和劑，作用后接種細(xì)胞培養(yǎng)。

（3）中和劑＋病毒懸液，接種細(xì)胞培養(yǎng)。

（4）消毒劑＋中和劑＋病毒懸液，接種細(xì)胞培養(yǎng)。

（5）病毒＋稀釋液，接種細(xì)胞培養(yǎng)。

（6）細(xì)胞＋稀釋液，接種培養(yǎng)。

【操作步驟】

第1組：取配制雙倍濃度的消毒劑0.5ml于試管內(nèi)，于20℃恒溫5min，加入0.5ml病毒懸液，混勻；作用至規(guī)定時(shí)間，再加入1ml去離子水，混勻取樣接種細(xì)胞培養(yǎng)。

第2組：取配制雙倍濃度的消毒劑0.5ml于試管內(nèi)，于20℃恒溫5min，加入0.5ml病毒懸液，混勻；作用至規(guī)定時(shí)間，再加入1ml中和劑，作用10min后，取樣接種細(xì)胞培養(yǎng)。

第3組：取0.5ml去離子水置于試管內(nèi)，恒溫水浴5min，加入0.5ml病毒懸液，混勻；再加入1ml中和劑，作用后，取樣接種細(xì)胞培養(yǎng)。

第4組：取雙倍濃度消毒劑0.5ml置于試管內(nèi)，恒溫水浴5min，加入1ml中和劑混勻作用10min；再加入0.5ml病毒懸液，作用10min后，取樣接種細(xì)胞培養(yǎng)。

第5組：取去離子水1.5ml于試管內(nèi)，恒溫5min，再加入病毒懸液0.5ml，混勻；取樣接種細(xì)胞培養(yǎng)。

第6組：取細(xì)胞接種維持液培養(yǎng)。

【結(jié)果判斷】

第1組無(wú)病毒生長(zhǎng)或有少量生長(zhǎng)；第2組有病毒生長(zhǎng)；第3、4、5組病毒生長(zhǎng)與原接種量一致；第6組細(xì)胞生長(zhǎng)正常。所選擇中和劑符合要求。

（五）過(guò)濾沖洗法清除試驗(yàn)

過(guò)濾沖洗法清除殘余消毒劑屬于物理方法，主要用于化學(xué)中和法效果不理想的消毒劑殺菌試驗(yàn)。過(guò)濾沖洗法的原理是利用特殊制備的稀釋沖洗液（一般使用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水，再加入低濃度（5～10g／L）吐溫-80）反復(fù)清洗吸附在菌體表面上的殘余消毒劑，然后將被阻留在濾膜上的細(xì)菌連同濾膜貼在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液上培養(yǎng)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

【試驗(yàn)材料】

用漏斗式濾器和孔徑在0.44μm微孔濾膜，滅菌后使用；真空泵或水抽濾泵；無(wú)菌稀釋液或沖洗液（多用含5g／L吐溫-80的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水）；常規(guī)無(wú)菌器材和培養(yǎng)液。

【操作步驟】

全部試驗(yàn)必須控制在20℃±1℃水浴條件下，應(yīng)在預(yù)備試驗(yàn)基礎(chǔ)上消毒劑控制在最低有效劑量條件下，其他條件也必須符合實(shí)際殺菌試驗(yàn)。

第1組：在無(wú)菌試管內(nèi)加入1.0ml試驗(yàn)濃度的菌懸液（視設(shè)計(jì)要求加或不加有機(jī)干擾物），恒溫后再加入4.0ml試驗(yàn)濃度1.25倍濃度的消毒液，立即混勻。作用至規(guī)定時(shí)間，振蕩混勻后取出0.5ml樣液，加入到盛有4.5ml稀釋液的試管內(nèi)。充分混勻后，取稀釋樣液接種無(wú)菌平皿，倒入熔化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，做活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)。

第2組：在無(wú)菌試管內(nèi)加入1.0ml試驗(yàn)濃度的菌懸液（視設(shè)計(jì)要求加或不加有機(jī)干擾物），恒溫后再加入4.0ml試驗(yàn)濃度1.25倍濃度的消毒液，立即混勻。作用至規(guī)定時(shí)間，將全部樣液倒入已經(jīng)連接好的濾器內(nèi)的濾膜上，啟動(dòng)真空泵進(jìn)行抽濾至樣液被抽干；再加入5ml沖洗液抽干，反復(fù)3次抽濾沖洗。將濾膜有菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液平板表面進(jìn)行培養(yǎng)后活菌計(jì)數(shù)。

第3組：在無(wú)菌試管內(nèi)加入1.0ml試驗(yàn)濃度的菌懸液（視設(shè)計(jì)要求加或不加有機(jī)干擾物），再加入4.0ml無(wú)菌硬水混勻。不加消毒液，但需作用至規(guī)定時(shí)間，取樣液進(jìn)行系列10倍稀釋，使試管內(nèi)總菌數(shù)在300以下，按上述方法進(jìn)行抽濾。然后將濾膜有菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液平板表面進(jìn)行培養(yǎng)后活菌計(jì)數(shù)。

第4組：在無(wú)菌試管內(nèi)加入1.0ml菌懸液，然后加入4.0ml沖洗液，立即混勻。不加消毒液，直接對(duì)其進(jìn)行系列稀釋，取樣液接種，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，作為陽(yáng)性對(duì)照組。

【結(jié)果判斷】

第1組無(wú)菌生長(zhǎng)，或僅有少數(shù)細(xì)菌；第2組有菌生長(zhǎng)且較第1組菌數(shù)明顯增多，但菌數(shù)明顯少于第3、4組；第3組生長(zhǎng)菌數(shù)與第4組菌數(shù)一致；第4組菌數(shù)應(yīng)為1×107～5× 107cfu／ml。若各組菌數(shù)符合上述要求，且連續(xù)3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明使用過(guò)濾沖洗法能有效清除殘余消毒劑。

（六）試驗(yàn)組設(shè)計(jì)及其意義

見表29-2。

表29-2　中和劑試驗(yàn)各組操作及其意義

（七）試驗(yàn)要求

1.綜合分析結(jié)果　認(rèn)真分析試驗(yàn)結(jié)果是否符合設(shè)計(jì)要求，得出清除殘余消毒劑的效果、試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的恢復(fù)、恢復(fù)培養(yǎng)液是否受到影響等關(guān)鍵結(jié)果的結(jié)論。

2.試驗(yàn)消毒劑濃度　要選擇有效臨界濃度和最短作用時(shí)間，因?yàn)闈舛冗^(guò)高把細(xì)菌全部殺滅，第2組試驗(yàn)總是無(wú)菌生長(zhǎng)無(wú)法進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)，作用時(shí)間最短不得少于30s，否則無(wú)法控制試驗(yàn)作用時(shí)間；濃度過(guò)低不能代表試驗(yàn)中最高試驗(yàn)消毒劑濃度，作用時(shí)間最長(zhǎng)不得超過(guò)實(shí)際殺菌所需時(shí)間。

3.試驗(yàn)代表菌　過(guò)濾沖洗法所用指標(biāo)菌要包括該消毒劑試驗(yàn)涉及所有細(xì)菌種類代表，細(xì)菌繁殖體可任選其中一種作代表，但涉及到細(xì)菌芽孢、真菌或分枝桿菌，則均需要納入試驗(yàn)，不得以細(xì)菌芽孢作代表，也不可用繁殖體作整個(gè)試驗(yàn)菌代表。

4.試驗(yàn)方法代表　過(guò)濾沖洗法中，懸液定量試驗(yàn)法選擇中和劑的結(jié)果可以用于載體定量法，但載體定量法選擇的中和劑結(jié)果不可簡(jiǎn)單用于懸液定量法，需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

5.載體定量法試驗(yàn)　載體定量殺菌試驗(yàn)中用過(guò)濾沖洗法清除殘余消毒劑，試驗(yàn)方法程序與懸液定量法相同，只是把菌懸液替換成染菌載體。