目前，已有多種組織工程皮膚產(chǎn)品成功應(yīng)用于臨床，如Epicel（培養(yǎng)的自體表皮移植物）、Dermagraft（采用有活性的異體Fb）及Apligraf（采用有活性的異體KC及Fb）等。但決定異體組織工程化皮膚移植成功和長期存活的生物學(xué)和免疫學(xué)因素非常復(fù)雜，加之文獻(xiàn)上有很多互相矛盾的地方，導(dǎo)致對(duì)組織工程皮膚免疫原性的認(rèn)識(shí)仍未統(tǒng)一。

一、移植細(xì)胞的免疫原性

目前，對(duì)表皮細(xì)胞的抗原性存在2種截然不同的觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為表皮細(xì)胞仍具有較強(qiáng)的抗原性，移植后數(shù)周甚至1周內(nèi)就會(huì)被排斥。受體朗格漢斯細(xì)胞可以進(jìn)入移植的培養(yǎng)表皮細(xì)胞中，并將異體MHC－Ⅱ類抗原或非MHC抗原呈遞給受體淋巴細(xì)胞，引起特異性免疫排斥反應(yīng)；另外一種觀點(diǎn)認(rèn)為在表皮細(xì)胞的培養(yǎng)過程，表皮細(xì)胞的抗原性發(fā)生了改變，供體的APC（朗格漢斯細(xì)胞及巨噬細(xì)胞）及白細(xì)胞減少或消失，產(chǎn)生免疫耐受，不能刺激受體的淋巴細(xì)胞發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，從而不引起受體的排斥反應(yīng)。

不同的細(xì)胞引起宿主免疫反應(yīng)的能力不同，即作為外來抗原被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的能力不同。最大潛能介導(dǎo)同種異體反應(yīng)的細(xì)胞被稱為專職APC，這種細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、B細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，這些細(xì)胞的共同特點(diǎn)之一是表面高表達(dá)MHC－Ⅱ分子。KC和Fb不是專職的APC，在正常情況下，兩者均不表達(dá)MHC－Ⅱ類抗原。在體外長期培養(yǎng)或IFN－γ的誘導(dǎo)下KC、Fb可以表達(dá)MHC－Ⅱ類分子，因此有可能獲得呈遞抗原給T細(xì)胞的能力。但是KC和Fb缺少共刺激分子如B7－1等，且不能分泌IL－12，所以由KC、Fb呈遞抗原不會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的活化，相反導(dǎo)致T細(xì)胞的不敏感。

二、細(xì)胞群純度問題

細(xì)胞群的純度也非常關(guān)鍵，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞群純度的差別可以導(dǎo)致研究結(jié)果的互相矛盾。低代的KC和Fb含有混雜細(xì)胞，其中包括專職抗原呈遞細(xì)胞（如朗格漢斯細(xì)胞）、過客白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，還包括黑素細(xì)胞等免疫原性較強(qiáng)的細(xì)胞成分。朗格漢斯細(xì)胞是表皮中最重要的抗原呈遞細(xì)胞，異體皮膚移植物是否被排斥與移植物內(nèi)的朗格漢斯細(xì)胞密度相關(guān)，密度越高，越易被排斥。現(xiàn)已證明，在皮膚中刺激異源性T細(xì)胞反應(yīng)并啟動(dòng)移植物排斥反應(yīng)的主要是朗格漢斯細(xì)胞。在混合表皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，表皮細(xì)胞刺激有絲分裂反應(yīng)的能力主要取決于朗格漢斯細(xì)胞的存在，清除供體皮膚的朗格漢斯細(xì)胞將延長異體移植物的存活時(shí)間。

移植物中的白細(xì)胞也是組織免疫原性的主要來源。這種細(xì)胞通常被稱為“過客白細(xì)胞”，過客白細(xì)胞提供供者M(jìn)HC－Ⅱ類抗原和共刺激分子，以激活異體反應(yīng)性CD4＋T細(xì)胞。一旦被激活，CD4＋T細(xì)胞返巢到移植物，分泌各種細(xì)胞因子，后者再激活同種異體反應(yīng)性CD8＋T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，活化的CD8＋細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞再引起對(duì)異體移植物的破壞。若無過客白細(xì)胞，雖然移植物組織表達(dá)同種抗原性MHC－Ⅰ類和Ⅱ類分子，但這些實(shí)質(zhì)細(xì)胞缺乏共刺激分子。與同種反應(yīng)性T細(xì)胞接觸，因?yàn)樵谌狈π盘?hào)2的情況下接受信號(hào)1的刺激，T細(xì)胞有可能被誘導(dǎo)成無能。

黑素細(xì)胞也是表皮中重要的細(xì)胞，現(xiàn)在認(rèn)為黑素細(xì)胞不僅具有保護(hù)機(jī)體免受紫外線的傷害，還有一定的免疫原性。體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞表面可以表達(dá)MHC－Ⅰ／Ⅱ類分子。另外在白癜風(fēng)和黑素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，黑素細(xì)胞表面和黑素瘤有特異性抗原表達(dá)。這些特異性抗原具有免疫原性，能夠激活皮膚內(nèi)樹突狀細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞將抗原呈遞給局部淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞，激活的淋巴細(xì)胞回到局部產(chǎn)生一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)。

不同的分離方法、培養(yǎng)條件和傳代次數(shù)都會(huì)影響細(xì)胞群的純度。改進(jìn)分離方法，如伍津津等分離表皮細(xì)胞時(shí)首先使用分離酶分離真皮和表皮，再用胰蛋白酶將表皮細(xì)胞消化為游離細(xì)胞，這種聯(lián)合消化的方法，一方面有較好的表皮細(xì)胞分離效果，另一方面避免了Fb等細(xì)胞的污染。使用限制性培養(yǎng)基，如適合KC生長的無血清培養(yǎng)基如K－SFM等，能夠抑制雜細(xì)胞的生長。在培養(yǎng)的過程中細(xì)胞不斷傳代，目的細(xì)胞呈優(yōu)勢生長狀態(tài)，進(jìn)一步去除雜細(xì)胞，通過以上途徑能夠提高培養(yǎng)細(xì)胞的純度，減少雜細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，尤其是免疫原性較強(qiáng)的細(xì)胞。有實(shí)驗(yàn)顯示，表皮細(xì)胞分離培養(yǎng)至一定代數(shù)時(shí)，未檢測到朗格漢斯細(xì)胞和黑素細(xì)胞，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)也明顯減弱，基本得到較純的KC，因此組織工程皮膚的工作細(xì)胞應(yīng)選取較高代數(shù)的細(xì)胞，降低組織工程皮膚的免疫原性。

三、三維培養(yǎng)條件下組織工程皮膚的免疫原性

IFN－γ是一種可以介導(dǎo)MHC－Ⅱ類抗原和CD40抗原表達(dá)的物質(zhì)。異體組織的急性排斥反應(yīng)是始于受者T細(xì)胞受體與供體細(xì)胞MHC－Ⅱ抗原結(jié)合。異體細(xì)胞的CD40與受者淋巴細(xì)胞CD154之間的相互反應(yīng)能促使異體細(xì)胞CD80或CD86的出現(xiàn)，導(dǎo)致排斥反應(yīng)。盡管Fb通常不表達(dá)CD80、CD86或者M(jìn)HC－Ⅱ，CD40也是低水平表達(dá)，但有研究顯示IFN－γ存在時(shí)誘導(dǎo)了FbMHC－Ⅱ類抗原和CD40的表達(dá)。真皮微環(huán)境無論在靜息狀態(tài)下還是炎癥條件下，都存在大量的細(xì)胞因子和細(xì)胞分化信號(hào)。這些細(xì)胞因子已經(jīng)被鑒定出來是真皮細(xì)胞的產(chǎn)物，其中包括內(nèi)皮細(xì)胞、Fb和肥大細(xì)胞等。在炎癥環(huán)境下，上調(diào)炎性細(xì)胞因子，其中包含IFN－γ等，可能影響到上述Fb表面抗原的表達(dá)。

分析Fb在體外單層培養(yǎng)和三維培養(yǎng)對(duì)IFN－γ的不同反應(yīng)讓我們看到了事物的另一個(gè)方面。來源于新生兒包皮的Fb單層培養(yǎng)時(shí)，IFN－γ能誘導(dǎo)其表達(dá)CD40和HLA－DR；而在Dermagraft中三維培養(yǎng)時(shí)，很少能誘導(dǎo)出上述抗原表達(dá)；如將Fb從Dermagraft分離出來單層培養(yǎng)時(shí)，又能引導(dǎo)出上述反應(yīng)。為了評(píng)價(jià)三維培養(yǎng)的免疫保護(hù)效果，將Fb培養(yǎng)于牛膠原凝膠中，加入IFN－γ，同樣觀察到了與單層培養(yǎng)一樣對(duì)CD40和HLA－DR的誘導(dǎo)效果。以上數(shù)據(jù)支持這樣一個(gè)假說：通過將Fb種植在支架上，伴隨有天然細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生而制成的組織工程移植物，在異體移植時(shí)，比只有細(xì)胞或者將細(xì)胞種植在牛膠原中所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)更少。Dermagraft對(duì)IFN－γ刺激缺乏反應(yīng)也得到有關(guān)在體真皮Fb對(duì)IFN－γ缺乏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)支持。肌注IFN－γ能誘導(dǎo)KC表達(dá)HLA－DR，但不能誘導(dǎo)真皮Fb的反應(yīng)。三維培養(yǎng)模式更接近細(xì)胞體內(nèi)的正常環(huán)境，在這種情況下，細(xì)胞如何受到保護(hù)，減弱免疫反應(yīng)，還需要進(jìn)一步深入研究。

四、角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的相互作用

研究表明，樹突狀細(xì)胞的表型和功能的形成與誘導(dǎo)微環(huán)境關(guān)系密切。GM－CSF＋I(xiàn)L－4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞屬于成熟型，能夠明顯刺激異體T細(xì)胞增殖。GMCSF＋I(xiàn)L－4與TGF－β1聯(lián)合培養(yǎng)的不成熟樹突狀細(xì)胞，其細(xì)胞表面MHC－Ⅱ類抗原呈中度或弱陽性，協(xié)同刺激分子CD80表達(dá)極弱，CD86陰性，不僅不引起宿主T細(xì)胞免疫應(yīng)答，且能誘導(dǎo)耐受。表皮朗格漢斯細(xì)胞屬于未成熟樹突狀細(xì)胞，這種未成熟表型與表皮中KC組成性分泌TGF－β1關(guān)系密切。TGF－β1顯著影響APC刺激T細(xì)胞活化作用，明顯減少T細(xì)胞分泌IL－2、IFN－γ等細(xì)胞因子，雖然不能避免異體移植物的排斥反應(yīng)，但是可以明顯延長移植物的存活時(shí)間。樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞作用可受多種因素破壞，如培養(yǎng)中加入低濃度GM－CSF、抗炎性細(xì)胞因子如IL－10或TGF－β1等，從而干擾樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用。正常皮膚的表皮和真皮之間不是相互獨(dú)立的，它們之間通過各自分泌的細(xì)胞因子相互聯(lián)系。有實(shí)驗(yàn)顯示，含表真皮的組織工程皮膚較單層培養(yǎng)KC和Fb分泌的IL－6明顯增高。這與KC、Fb的IL－1／IL－6環(huán)路有關(guān)。KC分泌IL－1，F(xiàn)b生成IL－6，IL－1促進(jìn)Fb生成IL－6，IL－6刺激KC增殖。體內(nèi)KC和Fb各自分泌多種細(xì)胞因子，并相互作用，能下調(diào)炎性細(xì)胞因子（如IFN－γ、IL－4），分泌的抗炎性細(xì)胞因子如IL－10等，是形成皮膚穩(wěn)定微環(huán)境的重要因素之一。一旦皮膚內(nèi)微環(huán)境被打破，朗格漢斯細(xì)胞很容易被激活，其MHC－Ⅰ、MHC－Ⅱ類分子表達(dá)上調(diào)，CD80、CD86、CD54、CD40等T細(xì)胞活化輔助分子的表達(dá)明顯增加。此時(shí)，其攝取抗原的能力明顯下降，而呈遞抗原的能力顯著增強(qiáng)。成熟樹突狀細(xì)胞不僅可以經(jīng)MHC－Ⅱ類分子途徑呈遞抗原肽段給細(xì)胞毒性T細(xì)胞，而且抗原經(jīng)MHC－Ⅰ類分子替代途徑呈遞抗原肽段給細(xì)胞毒性T細(xì)胞，分別刺激CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞增殖，產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)，而且這種激活很難再被IL－10逆轉(zhuǎn)。

五、支架材料

用于組織工程的支架材料可分為4大類，即合成高分子、天然高分子、無機(jī)材料及將這3類材料適當(dāng)混合的復(fù)合材料。天然高分子材料（膠原、纖維蛋白、海藻酸、透明質(zhì)酸、甲殼素等）的細(xì)胞相容性良好，應(yīng)用比較廣泛，但缺乏必要的力學(xué)特性和性能可調(diào)性，因此往往與合成高分子材料（聚交酯類、聚乙二醇、聚己內(nèi)酯及它們的共聚物等）復(fù)合，以利于改進(jìn)材料的綜合性能，滿足應(yīng)用要求。

膠原是由動(dòng)物細(xì)胞合成的一種生物高分子，是細(xì)胞外間質(zhì)的主要成分。由不同種類的動(dòng)物分離出來的膠原極其相似，不易被人體免疫系統(tǒng)作為異體識(shí)別，因此具有低抗原性，且有良好的生物相容性。Integra由Yannas和Burke于1980年研制的一種膠原類真皮替代品。它是由牛膠原提取物與硫酸軟骨素及氨基葡聚糖交聯(lián)而成的基質(zhì)與其上覆蓋的一層硅膠膜組成，膠原基質(zhì)的纖維直徑約7μm，孔徑為70～200μm，這種設(shè)計(jì)能使基質(zhì)與創(chuàng)床基底較好地整合，有利于Fb的浸潤及血管化過程。硅膠膜厚約0．02cm，具有良好的通透性和屏障性。臨床應(yīng)用時(shí)，將Integra移植于創(chuàng)面上，經(jīng)過2～3周，膠原基質(zhì)已充分血管化，這時(shí)除去硅膠膜，在其上移植自體薄皮片。由于這種膠原基質(zhì)幾乎無免疫原性，因而不會(huì)誘發(fā)機(jī)體排斥反應(yīng)。

殼多糖是甲殼素的脫乙?；a(chǎn)品，具有無毒、無味、生物相容性好，且無抗原性等優(yōu)點(diǎn)，其降解產(chǎn)物對(duì)人體無害，是目前研究的熱點(diǎn)。殼多糖分子中有許多氨基，帶正電荷，與膠原結(jié)合后，有利于上皮細(xì)胞的吸附和生長。殼多糖的纖維剛性結(jié)構(gòu)有可以增強(qiáng)真皮基質(zhì)的機(jī)械耐受力，延緩創(chuàng)面細(xì)菌膠原酶對(duì)真皮基質(zhì)的降解。以此原理制備的殼多糖／膠原復(fù)合真皮替代物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明移植物可以很好地覆蓋創(chuàng)面，未出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、排斥反應(yīng)。

透明質(zhì)酸一種天然多糖，包含N－乙酰葡糖胺和β－葡萄糖醛酸。廣泛存在于脊椎動(dòng)物結(jié)締組織尤其是皮膚中的細(xì)胞外基質(zhì)間，在體內(nèi)發(fā)揮著保護(hù)組織，穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和吸收沖擊力的作用。由于其本身是一種天然的細(xì)胞外基質(zhì)，具有生物相容性和無免疫原性等特點(diǎn)，使其廣泛應(yīng)用于臨床，其中包括補(bǔ)充關(guān)節(jié)腔液，眼外科的手術(shù)輔料和促進(jìn)手術(shù)后傷口愈合及再生。作為組織工程皮膚中細(xì)胞培養(yǎng)支架具有廣闊的前景。

六、培養(yǎng)基及凍存

目前，KC所用的培養(yǎng)基主要分為兩類，即有血清的培養(yǎng)基和無血清的培養(yǎng)基。血清的生物學(xué)效應(yīng)已被證實(shí)，它含有多種生長因子和活性物質(zhì)，能滿足大部分細(xì)胞生長的條件。但由于動(dòng)物血清成分極其復(fù)雜，對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物的分析、提純及檢測造成一定困難，且不明因子繁多，會(huì)影響KC生長調(diào)節(jié)機(jī)制及各項(xiàng)基因表達(dá)的精密調(diào)節(jié)。另外，動(dòng)物血清蛋白對(duì)人體來說是異種蛋白，培養(yǎng)的細(xì)胞植入人體后可能引起排斥反應(yīng)，因此國內(nèi)外學(xué)者正在不斷探索各種無血清培養(yǎng)基。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在出現(xiàn)了一系列無血清培養(yǎng)基，如K－SFM、MCDB153等。這些無血清培養(yǎng)基具有商品化、易于購買、成分清楚等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用，它的出現(xiàn)代表了今后培養(yǎng)基的發(fā)展方向。

組織工程皮膚種子細(xì)胞往往采用凍存的方法長期保存，凍存一般采用－196℃的液氮。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)經(jīng)冷凍處理后改變異體組織、細(xì)胞的免疫原性，減輕或延緩移植后排斥反應(yīng)的發(fā)生，從而提高移植效果。低溫冷凍造成組織、細(xì)胞免疫原性下降的機(jī)制可能有：①低溫冷凍破壞了移植物中殘存的抗原呈遞細(xì)胞，如表皮中的朗格漢斯細(xì)胞；②低溫冷凍破壞了細(xì)胞表面的抗原結(jié)構(gòu)；③低溫冷凍造成MHC抗原喪失。通過凍存這一過程，種子細(xì)胞免疫原性進(jìn)一步降低，減少了組織工程皮膚移植后免疫排斥的可能性。

七、基因工程技術(shù)的應(yīng)用

自DNA重組技術(shù)于1972年誕生以來，作為現(xiàn)代生物技術(shù)的核心基因工程技術(shù)得到飛速發(fā)展，基因工程技術(shù)應(yīng)用于皮膚組織工程的研究，開創(chuàng)了新的局面。KC是表皮最主要的細(xì)胞，也是組織工程皮膚最重要的種子細(xì)胞之一。KC表面的MHC－Ⅰ分子是導(dǎo)致免疫識(shí)別和同種異體細(xì)胞和組織排斥的主要原因。如何下調(diào)其表面MHC－Ⅰ分子的表達(dá)成為研究的熱點(diǎn)之一。Annette等用小鼠的KC轉(zhuǎn)染抗MHC－Ⅰ內(nèi)源性抗體的基因，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)內(nèi)源性抗體的細(xì)胞顯示MHC－Ⅰ似乎被“敲除”了，同時(shí)細(xì)胞生長和其他細(xì)胞表面分子未受到影響。值得注意的是，表達(dá)內(nèi)源性抗體的KC與正常KC相比，顯示不易被同種異體細(xì)胞毒性T細(xì)胞攻擊。這提示我們通過這種方法，可以減少同種異體組織工程皮膚移植物的免疫排斥反應(yīng)。