組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展至今，從培養(yǎng)對(duì)象來說，人體內(nèi)的組織和細(xì)胞幾乎無一不能培養(yǎng)。但由于細(xì)胞分化所導(dǎo)致的組織和細(xì)胞相互差異，各種組織細(xì)胞均有著不同的生物學(xué)個(gè)性，這反映在對(duì)體外培養(yǎng)條件上各有不同的要求，但是細(xì)胞培養(yǎng)也存在著共性和共同的需求條件，其基本原則是保證無微生物污染和不受其他有毒有害因素的影響。組織細(xì)胞培養(yǎng)的具體工作有器皿清潔、試劑和培養(yǎng)液的配制，分離培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞傳代、細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸?shù)?。以上過程均需堅(jiān)持無菌原則。本章著重介紹組織細(xì)胞培養(yǎng)的基本要求和操作要領(lǐng)，只要熟悉了這些基本內(nèi)容，并以其為基礎(chǔ)，其他不難掌握。

一、基本要求

（一）無菌操作

由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，故操作時(shí)應(yīng)做到嚴(yán)格無菌。無菌是決定培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。

（二）培養(yǎng)前的準(zhǔn)備

培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作必須做好，尤其對(duì)于初學(xué)者，應(yīng)制訂分門別類的操作卡片，各卡片記錄所需的器材和物品名稱、要求和數(shù)量等，這樣有利于統(tǒng)一消毒，避免因操作開始后，因物品不全在往返拿取時(shí)增加污染機(jī)會(huì)。

1．操作臺(tái)消毒　多用紫外線燈滅菌，效果好，用30W紫外燈，操作室根據(jù)面積大小消毒30～50min。凈化工作臺(tái)亦需設(shè)紫外線燈，主要用于消毒臺(tái)面和臺(tái)面上的用品，但對(duì)臺(tái)面流動(dòng)的空氣無意義。紫外線燈只有直接殺菌的作用，工作野用品過多或重疊放置，物品相互遮擋射線，會(huì)降低消毒效果。

2．洗手和著裝　原則上和外科手術(shù)相同。在利用無菌箱工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，洗刷時(shí)一定要清洗到肘部。一般用75%的乙醇擦洗消毒較方便，必要時(shí)亦可用0．2%苯扎溴銨洗滌消毒。在凈化工作臺(tái)操作時(shí)，需戴口罩和工作帽，著一般工作服，但無菌室內(nèi)工作需著消毒衣帽。

3．火焰消毒 無菌環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)或其他無菌操作時(shí)，首先要點(diǎn)燃用不含雜質(zhì)的95%乙醇的酒精燈。之后的一切操作，如開啟和封閉瓶口等，都需經(jīng)過火焰燒灼。但是，需注意的是金屬器械不能在火焰中燒過長(zhǎng)時(shí)間，且燒過的金屬器械要待冷卻后才能夾取組織，以免損傷組織。已吸取過培養(yǎng)液的吸管燒后不能再用，殘留的培養(yǎng)液被燒焦后形成碳膜，如再用會(huì)將有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液。

（三）培養(yǎng)操作

進(jìn)行培養(yǎng)操作時(shí)，要嚴(yán)格無菌操作，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，不能用手觸及已消毒的器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒觸及部或更換。工作臺(tái)上的東西應(yīng)擺放合理，工作要有一定的順序性，培養(yǎng)瓶在開瓶以后，應(yīng)保持45°或平放，開口向上可增加落菌機(jī)會(huì)。吸取不同培養(yǎng)用液時(shí)應(yīng)分別使用吸管，工作中不能面向操作野講話或咳嗽，以免增加污染機(jī)會(huì)。

（四）實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為無菌室、準(zhǔn)備室和洗刷消毒室。無菌室包括操作間和緩沖間。緩沖間能保護(hù)無菌間的無菌環(huán)境，可兼有更換無菌衣帽和進(jìn)行一些簡(jiǎn)單操作（如離心等）的功能。經(jīng)常消毒是保持無菌狀態(tài)所必需的，通常在使用前紫外線照射（1～2h），每周甲醛、乳酸或過氧乙酸熏蒸（2h）和每個(gè)月本扎溴銨擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。使用無菌室時(shí)應(yīng)按以下程序：①紫外線無菌室消毒，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料和器具；②手部消毒，穿戴無菌衣帽和口罩；③關(guān)閉殺菌燈，通過一定路線拿入必要物品；④手部再次消毒后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；⑤完成實(shí)驗(yàn)，將用完物品移出室外。

無菌室中一般在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，外界空氣通過過濾器從上面、側(cè)面或正面流入操作箱內(nèi)，形成氣流屏障，以保持臺(tái)面無菌。工作程序?yàn)椋孩俳油娫?，開紫外線燈進(jìn)行消毒15～30min；②打開操作窗，消毒手部后進(jìn)行操作；③操作完畢后清理超凈臺(tái)面，關(guān)閉操作窗，切斷電源。

二、基本操作技術(shù)

（一）器皿清洗

除了一些一次性無菌實(shí)驗(yàn)用品可用后即棄，其他的器材需要清洗后消毒滅菌，再重復(fù)使用。見本篇第25章第一節(jié)。

（二）消毒和滅菌

污染是導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因，通過消毒滅菌和無菌操作技術(shù)可以防止培養(yǎng)物污染。具體方法見本篇第25章第二節(jié)。

（三）取材

理論上，幼體個(gè)體組織比年老個(gè)體組織易于培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化程度高的組織容易生長(zhǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。在無特殊要求時(shí)，取易于培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)，成功率高。取材之后立即培養(yǎng)最好，如不能立即培養(yǎng)，應(yīng)把組織切成1cm× 1cm的小塊，置于培養(yǎng)液中，4℃保存，存放時(shí)間不宜超過24h，從體內(nèi)取材的組織，應(yīng)嚴(yán)格保持無菌。為減少污染，可能污染的組織培養(yǎng)前，可用含青霉素、鏈霉素的BSS液，漂洗數(shù)次后再培養(yǎng)。

（四）分離

從體內(nèi)取出的組織均由眾多結(jié)合緊密的細(xì)胞和纖維成分組成，體積大于1mm3的組織塊置于培養(yǎng)瓶后，組織塊中心的細(xì)胞因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)有限而代謝不良。為獲得多量的生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，必須把組織細(xì)胞分散開，能達(dá)到單細(xì)胞水平更好，分散細(xì)胞的方法分機(jī)械法和化學(xué)法。根據(jù)組織種類和培養(yǎng)要求，宜采用不同方法。

1．離心分離法　如培養(yǎng)物為細(xì)胞懸液，如血液、羊水、腹水、胸腔積液等時(shí)，可采用離心分離法，一般用低速離心每分鐘500～1 000轉(zhuǎn)，離心5～10min即可。如懸液量大，離心時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，但也不可速度過大和時(shí)間過長(zhǎng)，以免造成易壓擠導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2．機(jī)械分散法　主要用剪切法。一般將組織剪切成1mm3大小，再加Hanks液后，用吸管反復(fù)吸吹沖打，低速離心，去上清，余下組織進(jìn)行培養(yǎng)。某些軟組織，如腦、胚胎等，可將組織放入注射器壓擠法或?qū)⒔M織置于不銹鋼網(wǎng)中壓取法。機(jī)械法較簡(jiǎn)單易行，但對(duì)組織可能有一定損傷，較適用于軟組織。

3．消化分離法　是在把組織剪切成較小的體積的基礎(chǔ)上，應(yīng)用生化和化學(xué)的手段進(jìn)一步分散組織，這種方法較為常用，最后被處理的組織分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)皿中后容易生長(zhǎng)和繁殖。根據(jù)組織不同，消化手段也不同。

（1）胰蛋白酶消化法：應(yīng)用較廣，胰酶主要包括胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶。胰蛋白酶消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮組織、肝、腎等軟組織，對(duì)傳代細(xì)胞也非常好。胰蛋白酶的消化作用，與pH、溫度、組織大小、組織硬度及胰蛋白酶的濃度都有關(guān)系。胰蛋白酶的濃度在0．01%～0．5%范圍，常用0．25%濃度，37℃溫度，消化5mm3大小的胚胎類軟組織，20～30min即可。組織塊大或成體較硬組織，可延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)。當(dāng)置于4℃時(shí)，仍有緩慢消化作用，消化時(shí)間可延長(zhǎng)12～20h。濃度過大或消化時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞可被消化掉；但消化不充分也達(dá)不到分散細(xì)胞的目的。pH 8～9較好。因此，在新條件下使用胰蛋白酶時(shí)，可做些探試，以確定最佳參數(shù)。其程序?yàn)椋孩偌羟小０呀M織剪切成3mm×3mm×3mm的小塊。②加液。把組織置于比其量多30～50倍的0．25%胰蛋白酶中（預(yù)加溫至37℃）。③消化。37℃溫箱中消化30～60min，每隔5～10min搖動(dòng)一次或者置電磁攪拌器臺(tái)上消化。④消化完畢，倒入離心管中，每分鐘800轉(zhuǎn)離心6～8min后吸除上清液。⑤用Hanks液漂洗2～3min，離心去上清，共兩次。⑥每分鐘800轉(zhuǎn)離心5min后去上清，加入一定量的營(yíng)養(yǎng)液，通過100μm孔徑的篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液，用吸管吸取1滴細(xì)胞懸液滴于載物片上觀察，如細(xì)胞分散、形態(tài)完整，可用于培養(yǎng)。

（2）膠原酶消化法：膠原酶是一種從細(xì)菌中提取的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。膠原酶對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，而上皮細(xì)胞對(duì)其的耐受性好，所以膠原酶能使上皮細(xì)胞和膠原脫離而不受傷害，效果好。常用劑量為最終濃度200U／ml或0．1～0．3μg／ml。此酶消化作用緩和，且無須機(jī)械振蕩，消化過程為：①漂洗干凈的組織剪成1～5mm3的小塊，移入青霉素小瓶中；②加入適量0．2%膠原酶溶液；③置36．5℃中4～48h，如消化緩慢可延長(zhǎng)至3～5d，期間不必?fù)u動(dòng)；④如見組織已經(jīng)變軟，散于瓶底，振蕩后可散成細(xì)胞團(tuán)和單個(gè)細(xì)胞；⑤低速離心培養(yǎng)液5min，去上清，重懸于BSS中，再低速離心5min，去上清；⑥加入新培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，可接種進(jìn)行培養(yǎng)。另外，胰蛋白酶和膠原酶可以協(xié)同應(yīng)用，濃度為每毫升含胰蛋白酶0．1mg、膠原酶0．25mg。兩酶的差別見表26－1。

表26－1　胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別

除胰蛋白酶和膠原酶外，其他有消化作用的酶還很多，如鏈霉蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、黏蛋白酶等，需根據(jù)不同需求選用。

（3）EDTA消化法：EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）是一種非酶性消化物，常用不含Ca2＋和Mg2＋的BSS配成0．02%的工作液。關(guān)于EDTA的作用機(jī)制，一些學(xué)者有這樣的觀點(diǎn)。一些組織，尤其是上皮組織，在生存中需要Ca2＋和Mg2＋才能維持組織的完整性。EDTA能從這些組織生存環(huán)境中吸收這些離子，形成螯合物，能促進(jìn)細(xì)胞相互分離。EDTA作用比胰蛋白酶緩和，很少用于單獨(dú)消化新鮮組織（傳代細(xì)胞可單用），如與胰蛋白酶按不同比例相混合并用，消化作用更好。EDTA最適消化傳代細(xì)胞，也多與胰蛋白酶混合使用（1∶1或2∶1）。用EDTA和胰蛋白酶混合消化法傳代的過程如下：①吸出培養(yǎng)液，注入EDTA（0．02%）和胰蛋白酶（0．25%）混合液（1∶1），置37℃或室溫中作用3～5min。在鏡下監(jiān)視細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)見到細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體趨于變圓，細(xì)胞相互之間縫隙變大，立即終止消化。②吸出消化液，注入適量Hanks液輕輕洗1或2次，不要用力過猛，以免把附著不牢的細(xì)胞沖掉。③吸出Hanks液，加入適量培養(yǎng)液后，用吸管吸、吹培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之脫落入培養(yǎng)液中形成細(xì)胞懸液。

（雷　霞）

參 考 文 獻(xiàn)

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