由于活細(xì)胞無色透明，當(dāng)光波通過時(shí)，顏色和亮度改變不大，反差很小，所以用一般光學(xué)顯微鏡觀察活細(xì)胞時(shí)難以看清楚細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡則能很好地解決這一問題，它是利用細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)密度不同而導(dǎo)致光折射率有差異的原理，使肉眼不能分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹睿疵靼挡睿?，這樣無色透明的物體在鏡下觀察時(shí)其結(jié)構(gòu)形成顯著反差，能夠清晰成像。因此，相差顯微鏡特別適合于：①觀察不染色的活細(xì)胞標(biāo)本，或是染色所不能顯示的微細(xì)結(jié)構(gòu)；②觀察活細(xì)胞的活動(dòng)特性及活細(xì)胞的生理及病理變化。

使用相差顯微鏡觀察時(shí)對(duì)光路要求高，首先是光軸要對(duì)正，其次是視野照明光度應(yīng)均勻，其光軸對(duì)正（合軸）的方法是：①先調(diào)好相位板，使聚光器相位板號(hào)與物鏡放大倍數(shù)相一致；②抽出目鏡，換上中心望遠(yuǎn)鏡，對(duì)準(zhǔn)中心望遠(yuǎn)鏡的焦點(diǎn)，便可見到2個(gè)光環(huán)，即相板上的圓環(huán)和環(huán)狀光闌的亮環(huán)，調(diào)整聚光器上的調(diào)節(jié)鈕，使視野中2個(gè)大小一樣的光環(huán)完全重疊；③再換上原目鏡，即成相差圖像；當(dāng)更換不同倍數(shù)物鏡時(shí)需按上述過程重新調(diào)節(jié)。有時(shí)可出現(xiàn)2個(gè)圓環(huán)大小不一致的情況，若環(huán)狀光闌的亮環(huán)比相板的圓環(huán)小而位于內(nèi)側(cè)時(shí)，應(yīng)降低聚光器；反之，應(yīng)升高聚光器致最大限度。如果仍不能糾正，可能是載玻片過厚，應(yīng)予更換適當(dāng)厚度的載玻片。

視野照明度應(yīng)均勻，其調(diào)節(jié)方法是：在調(diào)整顯微鏡的光軸基礎(chǔ)上，先將光圈關(guān)至最小，使用低倍鏡，讓光落于視野中央，如存在偏斜現(xiàn)象，可轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器的調(diào)節(jié)鈕來調(diào)整。然后打開光圈，并調(diào)節(jié)反射光鏡使視野照明均勻，使被檢物達(dá)到最大限度的反差圖像。

使用時(shí)有以下基本要求：①要求培養(yǎng)瓶和皿底部平坦、質(zhì)地均勻、透光度好，塑料培養(yǎng)瓶完全滿足這些要求，最為理想，玻璃瓶底面凹凸不平，相差觀察效果差，攝影更差；②觀察和攝像前要擦凈培養(yǎng)瓶表面，以免污跡殘留影響透光度；③調(diào)整照明光的照明度，令視野照明均勻，對(duì)正光軸是顯微攝影的重要條件，不可忽視；④攝影時(shí)如無自控?cái)z像裝置，應(yīng)把放大倍數(shù)、光圈大小、照明強(qiáng)度和曝光時(shí)間等條件逐一記錄下來，做一組不同曝光時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，顯影后選最佳組合，作為以后再拍攝時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)；目前采用數(shù)碼相機(jī)或CCD攝影頭采集圖像更為方便；⑤相位膜有推遲直射光和衍射相位的作用，利用相位膜推遲直射光的明負(fù)反差，如推遲衍射光的暗正反差。一般相板多為吸收（推遲）直射光的類型，通常使用推遲波長(zhǎng)的相位膜，如明暗反差過強(qiáng)，可使用推遲波長(zhǎng)的相位膜，反之亦然。

倒置相差顯微鏡是細(xì)胞培養(yǎng)觀察最直接的重要工具。因此，正確使用倒置顯微鏡是細(xì)胞培養(yǎng)研究的基本技能。倒置顯微鏡的光源和聚光器位于載物臺(tái)上方，物鏡在載物臺(tái)下方，載物臺(tái)上可以放置培養(yǎng)瓶／皿，便于觀察貼壁生長(zhǎng)的活細(xì)胞，相對(duì)普通光學(xué)顯微鏡其光路正好顛倒過來，故稱倒置顯微鏡。而倒置相差顯微鏡主要是在倒置顯微鏡上配有相差長(zhǎng)焦距聚光器和相差物鏡而成，還可以裝配暗視野聚光器、熒光顯微鏡光源和濾片，以進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)觀察。這種顯微鏡的載物臺(tái)除可以放置培養(yǎng)瓶皿外，還可裝配恒溫調(diào)節(jié)器、各種顯微操作器等，如再配置照相機(jī)、電視機(jī)或電影攝影機(jī)，就可以記錄和連續(xù)觀察活細(xì)胞的系列變化，拍成連續(xù)的照片和電影片等，使觀察更為直觀和形象。因此，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自己的研究要求，選購合適的相差顯微鏡。