一、目的要求

學(xué)習(xí)顯微計(jì)測和顯微描繪的一般方法。 要求掌握接目測微尺的標(biāo)定方法，測量出1~2種病菌孢子大小，學(xué)會在顯微鏡上安裝和使用顯微描繪儀并描繪出1~2個(gè)病菌孢子。

二、材料和用具

（一）實(shí)驗(yàn)材料

玉米小斑病菌（Bipoloris maydis）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）孢子懸浮液，以及其他病原菌材料。

（二）實(shí)驗(yàn)用具

接目測微尺、鏡臺測微尺、血球計(jì)數(shù)板、顯微描繪儀、培養(yǎng)皿、吸管等。

三、內(nèi)容和方法

（一）顯微計(jì)測

顯微計(jì)測就是在顯微鏡下測定病原物形態(tài)的大小，并用加權(quán)平均數(shù)和大小幅度來表示。 常用的是接目測微尺計(jì)測法。 接目測微尺（簡稱“目尺”），是一片可以裝入目鏡的圓形玻片，其上有1把小尺（50格），每1格所代表的長度因顯微鏡放大倍數(shù)不同而異。 因此需用鏡臺測微尺校準(zhǔn)，以求出在該顯微鏡一定放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下目尺每小格所代表的相對長度。鏡臺測微尺（簡稱“臺尺”）是一片大小形狀和載玻片相似的特制玻片，中央有一個(gè)圓圈，正中央刻有1把尺，長1mm，均分為10大格，100小格，每小格為0.01mm（即10μm）。

1.接目測微尺的校準(zhǔn)

（1）安裝目尺

取出目鏡，把目鏡上的透鏡旋下，將用擦鏡紙擦干凈的目尺刻度面朝下放在目鏡鏡筒內(nèi)的隔板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。

（2）校準(zhǔn)目尺

將臺尺刻度面朝上放置于顯微鏡載物臺上。 先用低倍鏡觀察，將臺尺有刻度的部分移到視野中央，調(diào)節(jié)焦距。 在能清晰地看到臺尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡使目尺與臺尺的刻度平行。 利用推動器移動臺尺，使目尺和臺尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重合線之間臺尺和目尺所占的格數(shù)。如此重復(fù)3次，如下表。

表4-1 顯微鏡目尺校準(zhǔn)結(jié)果示例

臺尺：6格＋12格＋30格＝48格

目尺：13格＋25格＋64格＝102格

在此目鏡和物鏡放大倍數(shù)下，目尺每格代表的長度（L）算法如下：

用同樣的方法換成中、高倍鏡和油鏡進(jìn)行校準(zhǔn)，分別測出在中、高倍鏡和油鏡下目尺每格所代表的長度。

觀察時(shí)光線不宜過強(qiáng)，否則難以找到臺尺的刻度；換到高倍鏡和油鏡進(jìn)行校準(zhǔn)時(shí)，務(wù)必十分小心，防止物鏡壓壞臺尺和損壞鏡頭；目尺換用在其他顯微鏡上或鏡頭和鏡筒的長度有所改變時(shí)，必須重新校準(zhǔn)。

2.病原菌形態(tài)大小的測定

將病原菌制成臨時(shí)玻片，安放在載物臺上，在低倍鏡下測定病原菌（如孢子）的長寬所占目尺的格數(shù)并記錄。 隨機(jī)選取30個(gè)孢子，測定其長寬并記錄。 最后算出該放大倍數(shù)下所測孢子的大小幅度和加權(quán)平均數(shù)。

孢子大小表示方法：最短~最長（長度平均值）μm×最窄~最寬（寬度平均值）μm

如：12.1~22.4（18.4）μm×3.5~5.0（4.6）μm

制片時(shí)最好用清水作浮載劑，而不用乳酚油；以成熟的病原菌為準(zhǔn)而不測未成熟的；菌絲體一般測量基部直徑，孢子測量長寬，子囊果、分生孢子器測量縱橫直徑，均以最長、最寬處為準(zhǔn)。

3.真菌孢子或細(xì)菌數(shù)量的測量

測定液體中孢子濃度的方法很多。 除了菌落計(jì)數(shù)和比濁法外，常用的是用血球計(jì)數(shù)板來測量孢子的數(shù)量。

（1）血球計(jì)數(shù)板是1塊特制的加厚載玻片，中部有2條縱槽，1條橫槽，組成“H”形，在上下兩個(gè)方框中刻有高度精確而纖細(xì)的刻線，加放蓋玻片后，上下兩方框離蓋玻片的距離為0.1mm。 在每個(gè)方框中有9個(gè)邊長各為1mm的大格，中間1個(gè)大格的部位（血球計(jì)數(shù)室）適合測孢子的數(shù)量，這個(gè)大格的邊長為1mm，面積為1mm2。這個(gè)大格又分成25個(gè)中格，每個(gè)中格都用雙線分開，中格邊長為0.2mm，面積為0.04mm2。每個(gè)中格又分成16個(gè)小格，每個(gè)小格邊長為0.05mm，面積為0.0025mm2，即1／400mm2，所以每個(gè)大格的體積為0.1mm3,每個(gè)中格的體積為0.004mm3,每個(gè)小格的體積為1/4000mm3。

每毫升孢子數(shù)量＝每小格平均孢子數(shù)×4000×1000＝每個(gè)小格有菌數(shù)×4000000

（2）菌液孢子濃度的測定：首先將培養(yǎng)的菌液搖勻后用滴管滴在中央平臺上，蓋上蓋玻片。 如果菌液濃度過大，則要先稀釋，再將稀釋的菌液用來鏡檢、計(jì)數(shù)。 通常檢查5個(gè)中格內(nèi)的孢子數(shù)，5個(gè)中格分別在4個(gè)角上和中央，共計(jì)80個(gè)小方格。計(jì)數(shù)的方格多且分布在不同方位上，可以避免孢子在各方位上分布不均所造成的誤差。

每毫升測量的菌液中孢子濃度=80個(gè)小格中孢子總數(shù)×4000000÷80=80個(gè)小格中孢子總數(shù)×50000

（二）顯微描繪

1.使用方法

在顯微鏡檢時(shí)，可以徒手描繪，但是較準(zhǔn)確的是用顯微描繪儀。 顯微描繪儀的種類很多，它們都是利用棱鏡折光的原理，操作的關(guān)鍵是調(diào)節(jié)光線。當(dāng)顯微鏡中病菌上的光亮度與繪圖紙上筆尖的光亮度相接近時(shí)，就能按實(shí)物的形狀描繪。 在使用時(shí)應(yīng)注意如下事項(xiàng)：

（1）反光鏡位置的角度應(yīng)為45°。

（2）在未畫完之前切勿移動描繪儀和繪圖紙。

（3）描繪用的鉛筆筆頭要削尖。

（4）調(diào)節(jié)顯微鏡光的強(qiáng)度，使所描繪的物體與筆尖都能同時(shí)被看得很清楚。

（5）先用描繪儀繪出草圖，然后再做精細(xì)的修整。

每個(gè)同學(xué)在顯微描繪儀下描繪玉米小斑病菌分生孢子，先作草圖，然后修整。

2.使用技巧與注意事項(xiàng)

（1）布點(diǎn)

布點(diǎn)是一項(xiàng)細(xì)致而費(fèi)工的技巧。 點(diǎn)要點(diǎn)得圓，點(diǎn)得勻，點(diǎn)子的排列，要保持整齊、均勻，均勻中求變化，變化中要統(tǒng)一。 所以應(yīng)有計(jì)劃（心中有數(shù)）地從明處點(diǎn)起，小心而慢慢地點(diǎn)，一行行交互著點(diǎn)，不要等到畫好看著太疏而再加點(diǎn)子，再加的點(diǎn)子反而會變得不均勻。 明的部分、色淡的部分點(diǎn)子小些、稀些，暗的部分、色深的部分點(diǎn)子要大些、密些。

（2）劃線

劃線是繪圖的又一基本功，一般以肘貼桌面，掌側(cè)和小指抵圖紙，緊握筆桿，從左下向右上的方向運(yùn)筆，同時(shí)應(yīng)閉氣用力，使線條均勻、光滑、流暢，一般來說，不應(yīng)露出筆尖起落的痕跡。 筆尖含墨的多少，壓筆力的大小，常引起線點(diǎn)的粗細(xì)變化，要多加體會運(yùn)用。

（3）注意事項(xiàng)

繪圖時(shí)必須安靜有耐心，特別是換用繪圖儀描繪時(shí)，座位的高低必須合適，以免容易疲勞。 草圖應(yīng)一氣繪成，不要中途停頓。

四、實(shí)習(xí)時(shí)間

1天。

五、作業(yè)與思考題

1.校準(zhǔn)目尺，將數(shù)據(jù)填入下表。

表4-2 顯微鏡目尺校準(zhǔn)結(jié)果

2.測量病原菌分生孢子的大小，寫出報(bào)告，并顯微繪圖。

3.進(jìn)行顯微描繪時(shí)，時(shí)常發(fā)生看不清病菌或看不清鉛筆尖的情況，應(yīng)該怎么辦才能使病菌、紙和筆尖都看得清楚？

4.病原物形態(tài)圖的繪制，一般經(jīng)過哪幾個(gè)步驟？如何很好地完成這些繪圖步驟？每一步應(yīng)注意哪些問題？