本節(jié)熱門考點

1.凝集反應(yīng)是顆粒性抗原（細(xì)菌、細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在的條件下特異性結(jié)合后形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊，沉淀反應(yīng)是可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在適當(dāng)條件下出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線。

2.免疫學(xué)檢測的三大標(biāo)記技術(shù)：酶免疫測定、免疫熒光技術(shù)和放射免疫測定。

3.淋巴細(xì)胞分離的主要方法：葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法，磁珠分離法，流式細(xì)胞術(shù)分離法。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原理和應(yīng)用。

4.細(xì)胞因子的檢測：①生物活性測定法；②免疫學(xué)測定法，包括RIA和ELISA；③分子生物學(xué)法，包括原位雜交法和RT-PCR法。

一、抗體的檢測及應(yīng)用抗體進(jìn)行的檢測

1.概念　抗原與抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原的抗原決定基與抗體的抗原結(jié)合部位之間的結(jié)構(gòu)互補性，二者相互結(jié)合，通過一定方法，出現(xiàn)可見的反應(yīng)。

2.血凝抑制　當(dāng)病毒的懸液中加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲貢r，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蜓刂苯咏佑|，這時紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為血凝抑制反應(yīng)。

3.凝集反應(yīng)和血型的鑒定　細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在的條件下結(jié)合后形成凝集團(tuán)塊，這一類反應(yīng)稱為凝集反應(yīng)。ABO血型檢測就是利用玻片凝集試驗，進(jìn)行抗原的定性檢測。

4.免疫熒光　免疫熒光法是用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中的抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察或采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測的技術(shù)。免疫熒光法可用于檢查細(xì)菌、病毒、螺旋體等的抗原或相應(yīng)抗體，幫助傳染病的診斷。此外，還用于鑒定免疫細(xì)胞的CD分子，檢測自身免疫病的抗核抗體等。

5.放射免疫　放射免疫測定法是用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測的技術(shù)，檢測的敏感度可達(dá)pg/ml水平。

6.酶免疫（ELISA和免疫組化）　酶免疫測定是用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，通過洗滌將固相上的抗原抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分開，再采用酶-底物系統(tǒng)進(jìn)行檢測的技術(shù)。免疫組化技術(shù)是用標(biāo)記物標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞的抗原反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查，對抗原進(jìn)行定性、定量、定位檢測的技術(shù)。

7.免疫電鏡　將抗體進(jìn)行特殊標(biāo)記后用電子顯微鏡觀察免疫反應(yīng)的結(jié)果，稱為免疫電鏡技術(shù)。根據(jù)標(biāo)記方法的不同，分為免疫鐵蛋白技術(shù)、免疫酶標(biāo)技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)。

8.免疫沉淀　免疫沉淀法是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)之間相互作用的重要工具。它可以靈敏地檢測目標(biāo)蛋白與其他蛋白或DNA片段的結(jié)合情況，還可以用于研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及基因表達(dá)等。

9.免疫印跡　免疫印跡法又稱Western blotting，是將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測定。

二、免疫細(xì)胞的分離（常用方法）

1.Ficoll-Hypaque離心法　體外檢測淋巴細(xì)胞，首先需制備外周血單個核細(xì)胞，常用的方法是葡聚糖-泛影葡胺（又稱淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法。

2.磁珠分離法　將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)物稱為微珠（平均直徑小于1.5μm的磁性顆粒），與細(xì)胞懸液反應(yīng)后，磁珠借抗體結(jié)合于相應(yīng)細(xì)胞群或亞群表面。再將細(xì)胞懸液加于一試管內(nèi)并置磁場中，因磁珠被磁場吸引，將磁珠結(jié)合的細(xì)胞與未結(jié)合磁珠的細(xì)胞分開。

3.流式細(xì)胞術(shù)　流式細(xì)胞術(shù)是借助熒光激活細(xì)胞分選器（FACS）對免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定和分類的技術(shù)。

流式細(xì)胞術(shù)：①測量速度快；②可進(jìn)行多參數(shù)測量；③是一門綜合性的高科技方法；④既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。

三、免疫細(xì)胞的特異性、數(shù)量和功能檢測

1.流式細(xì)胞術(shù)　根據(jù)表面表達(dá)CD分子的種類、水平和多種CD表達(dá)格局，以流式細(xì)胞術(shù)可以二維熒光方圖和比例統(tǒng)計顯示待測細(xì)胞群體中某群CD+細(xì)胞的比例及數(shù)量、CD分子表達(dá)水平的高低，同時以IFNγ等細(xì)胞因子或AnnexinV凋亡標(biāo)志等，可測定的功能性CTL、凋亡細(xì)胞的比例，以FITC等標(biāo)記靶細(xì)胞，通過熒光強度的減弱程度可測定CTL的殺傷活性。

2.增殖試驗

（1）3H-TdR摻入法：在PBMC中加入PHA共同培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前8～15小時加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），由于3H-TdR能摻入細(xì)胞合成的DNA中，細(xì)胞增殖水平越高，摻入的放射性核素越多。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，用液體閃爍儀測定樣品的放射活性，反映細(xì)胞的增殖狀況。

（2）MTT法：MTT是一種噻唑鹽，化學(xué)名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑。在細(xì)胞培養(yǎng)終止前數(shù)小時加入的MTT，作為細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶的底物參與反應(yīng)，形成紫褐色的甲臜顆粒并沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍。甲臜可被鹽酸異丙醇或二甲基亞砜完全溶解，用酶標(biāo)測定儀測定細(xì)胞培養(yǎng)物的OD值，反映細(xì)胞增殖水平的高低。

3.細(xì)胞毒試驗　CTL、NK細(xì)胞對靶細(xì)胞有直接殺傷作用，可根據(jù)待檢效應(yīng)細(xì)胞的性質(zhì)，選用相應(yīng)的靶細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、移植供體細(xì)胞等。可采用51Cr釋放法、乳酸脫氫酶釋放法以及凋亡細(xì)胞檢查法進(jìn)行檢測。

4.細(xì)胞凋亡檢測　檢查靶細(xì)胞凋亡有多種方法：如瓊脂糖電泳法、TUNEL法和流式細(xì)胞術(shù)等。

5.芯片技術(shù)　目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列為分析對象的“微陣列”，也被稱為基因芯片或DNA芯片。

6.細(xì)胞因子的生物活性檢測　根據(jù)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性，選用相應(yīng)的實驗系統(tǒng)，包括細(xì)胞增殖法、直接殺傷法、保護(hù)細(xì)胞免受病毒致病變法等。如選用細(xì)胞因子依賴的細(xì)胞株，其增殖反應(yīng)水平與細(xì)胞因子的含量成正相關(guān)，根據(jù)細(xì)胞株的增殖水平可確定樣品中細(xì)胞因子（如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6等）的含量。