(一)等位基因特異性寡核苷酸分析法

等位基因特異性寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide,ASO)分析法是一種以雜交為基礎(chǔ)檢測已知突變的技術(shù)。

1.基本原理 ASO是一段20bp左右核素或熒光素標記的寡核苷酸探針(包含發(fā)生突變的部位)。用其與固定在膜上的經(jīng)PCR擴增的樣品DNA雜交,由于完全互補DNA二聚體較有錯配的DNA二聚體(雜交產(chǎn)物)穩(wěn)定,通過與陽性、陰性樣品對照,可判斷出樣品DNA基因型。

2.基本操作步驟

(1)以待檢測樣品DNA為模板,PCR擴增含有突變部位的目的基因片段。

(2)將PCR產(chǎn)物通過電泳膠(southern blot)或直接點滴(dot blot)轉(zhuǎn)到膜上。

(3)DNA變性(如將膜浸入0.1M NaOH溶液)。

(4)ASO與膜上DNA雜交(可通過中和NaOH的方法,完全互補的DNA-ASO二聚體穩(wěn)定存在,而有錯配的二聚體溶解)。

(5)顯色(根據(jù)ASO上標記的發(fā)光物質(zhì)選擇合適的顯色方式,如X線膠片曝光顯影)。

(6)結(jié)果判斷(根據(jù)設(shè)置的陽性、陰性對照判斷樣品基因型)。

(7)更換ASO,重復(fù)雜交(可通過沸水洗掉膜上已檢測探針,加入新探針重復(fù)雜交過程)。

(二)單鏈構(gòu)象多態(tài)性和異源雙鏈分析法

單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand comformational polymorphism,SSCP)和異源雙鏈分析法(heteroduplex analysis,HA)是利用電泳檢測未知突變的技術(shù)。

1.基本原理 單一堿基變化也能夠改變DNA單鏈構(gòu)象,從而造成電泳遷移率的改變(SSCP);在DNA雙鏈中,單一堿基變化導(dǎo)致局部錯配發(fā)生,DNA雙鏈構(gòu)象發(fā)生改變,從而造成同源雙鏈和異源雙鏈間電泳遷移率的差異(HA法)。根據(jù)電泳遷移率的變化可判斷被檢測DNA片段中是否存在基因突變。

2.基本操作步驟

(1)以待檢測樣品DNA為模板,PCR擴增可能含有突變的目的基因片段。

(2)變性:將PCR產(chǎn)物98°C變性10min,立即冰浴驟冷,使其成為單鏈(SSCP)或于68°C復(fù)性為同源/異源雙鏈(HA法)。

(3)電泳:非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

(4)染色:如在PCR擴增中用核素或熒光素等標記引物或核苷,可用X線膠片曝光顯影,也可在電泳后用銀或溴化乙錠染色顯示結(jié)果,再根據(jù)泳動速率變化,判斷突變有無。

3.檢測注意事項 用PCR-SSCP法檢測片段小于200bp的PCR產(chǎn)物時,突變檢出率可達70%~95%,而片段大于400bp時,檢出率僅為50%左右;該法可能會存在1%的假陽性率。HA法分離也只適合于小片段的分析。但HA對一些不能用SSCP檢出的突變有互補作用,兩者結(jié)合使用,可使突變檢出率提高到接近100%。