常見生物樣品的預(yù)處理流程見圖2－3。

圖2－3　常見生物樣品的預(yù)處理流程

根據(jù)不同生物樣品類型的特點及藥物的存在形式，需事先將被測物轉(zhuǎn)化成易于提取純化的形式。例如血樣經(jīng)去蛋白可以減少后續(xù)提取純化的難度;尿液中以綴合物形式存在的藥物經(jīng)水解后脂溶性增強，利于后續(xù)的提取純化;藥物與毛發(fā)中的組分結(jié)合牢固，需經(jīng)有機破壞才可使其釋放，進而被提取純化。如果選用的分析方法特異性強，可不經(jīng)提取純化直接測定。對于提取純化后藥物濃度較低的樣品需要進行富集，有必要的時候可采用化學(xué)衍生化方法提高分析的靈敏度和特異性。通常體內(nèi)藥物分析測定的是藥物或代謝物的總濃度(包括游離型及結(jié)合型)，但在一些特殊情況下，如蛋白結(jié)合率試驗，則需要將游離型藥物與結(jié)合型藥物分離，測定游離藥物的濃度。

下面就常見的預(yù)處理方法:去除蛋白質(zhì)、綴合物水解、有機破壞、游離藥物的分離、提取純化、富集、化學(xué)衍生化進行討論。

2.2.2.1　去除蛋白質(zhì)

血樣和組織樣品中存在大量的蛋白質(zhì)，藥物在這些樣品中可能以蛋白結(jié)合的形式存在。一般情況下蛋白沉淀的時候，藥物會被釋放出來，可測得藥物的總濃度。另外蛋白質(zhì)為大分子物質(zhì)，對后續(xù)的提取純化干擾很大，對分析儀器的污染也很嚴(yán)重。去除蛋白質(zhì)的方法有多種，根據(jù)原理可分為三類:蛋白質(zhì)沉淀法和蛋白質(zhì)溶解法。

1.蛋白質(zhì)沉淀法

蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，在水中可溶的原因有兩個方面:一是蛋白膠粒上的電荷互相排斥，不易凝集成團;二是膠粒表面的水化膜，使其與水充分接觸，又可在膠粒之間起隔離作用。當(dāng)這兩種平衡被破壞時，蛋白質(zhì)將會沉淀析出。根據(jù)作用機理大致可分為兩類。

(1)鹽析和脫水:高濃度的鹽離子可與蛋白質(zhì)膠粒爭奪水化膜，同時抑制蛋白質(zhì)的解離，減少蛋白質(zhì)膠粒表面的電荷，從而破壞水化膜使其凝聚沉淀。常用的中性鹽有:飽和硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉及磷酸鹽等。如按血清與飽和硫酸銨的比例為1 2混合，即可除去90%以上的蛋白質(zhì)。所得上清液的pH為7.0～7.7。采用此法時要注意中性鹽殘留對分析儀器的影響。

與水相混溶的有機溶劑，如乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃等，可與蛋白質(zhì)爭奪水化膜，降低水的介電常數(shù)，抑制蛋白質(zhì)的解離，使表面的電荷量減少，增加蛋白質(zhì)顆粒之間的引力，使其聚集沉淀。沉淀蛋白效果最好的是乙腈，在生物樣品中加入1.5倍體積的乙腈即可以除去99%以上的蛋白質(zhì)，所得上清液的pH為8.5～9.5。采用此法會稀釋樣品，降低方法的靈敏度，同時會帶來較多的干擾成分。但該法操作簡單，尤其適合極性較大的藥物。

鹽析法一般不會引起蛋白質(zhì)變性，常用于蛋白質(zhì)的分離。而有機溶劑與蛋白質(zhì)接觸較久后，會使其變性，形成不可逆沉淀。

(2)成鹽:蛋白質(zhì)為兩性大分子，結(jié)構(gòu)中既有羧基又有氨基。當(dāng)溶液的pH高于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)的羧基帶負(fù)電荷，可與帶正電荷的重金屬鹽類結(jié)合形成不溶性鹽而沉淀;當(dāng)溶液的pH低于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)的氨基帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的酸根離子結(jié)合形成不溶性鹽而沉淀。常用的酸性陰離子沉淀劑有三氯乙酸、高氯酸、鎢酸鹽等，常用的重金屬鹽類主要有鋅鹽、銅鹽和汞鹽。其中三氯乙酸的沉淀效果最好，按血清與三氯乙酸的比例為1 0.2混合，即可除去99%以上的蛋白質(zhì)。所得上清液的pH為1.4～2.0，在酸性條件下易分解的藥物不宜采用本法。

(3)加熱使變性:當(dāng)待測成分熱穩(wěn)定性好時，可采用加熱的方法除去熱變性蛋白，加熱溫度視待測成分的熱穩(wěn)定性而定，通常加熱至90℃。該法簡單，但除蛋白質(zhì)的效果一般，現(xiàn)在很少應(yīng)用。

析出的蛋白質(zhì)必須采用超速離心機(≥10000 r·min－1)離心1～2 min才可完全除去，離心時選用超速離心機專用的具塞塑料尖底管，可使析出的蛋白質(zhì)牢固地粘在管底，便于上清液與沉淀的分離。

2.水解蛋白質(zhì)法

蛋白質(zhì)的肽鍵在蛋白水解酶的作用下可發(fā)生降解，釋放出結(jié)合的藥物。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素，通常在50～60℃的堿性pH溶液(pH7.0～11.0)中水解。也可合用一些蛋白酶增活劑，以便減少酶用量和縮短水解時間。對于酸不穩(wěn)定、熱不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物，此法是不錯的選擇。但此法不適用于在堿性條件下易水解的藥物。

2.2.2.2　綴合物水解

含羥基、羧基、氨基和巰基等基團的藥物及具有類似基團的Ⅰ相代謝物，可與內(nèi)源性物質(zhì)(如葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等)形成綴合物(conjugate)，經(jīng)腎臟排泄。由于綴合物的極性一般較原型藥物大，具有較大的親水性或在生理pH下以電離形式存在，不易被有機溶劑提取。為了測定藥物總量，無論是直接測定或萃取分離之前，常需將綴合物中的藥物或代謝物水解游離出來。常用的方法有酸水解、酶水解和溶劑解。

1.酸水解

加入適量的無機酸可使綴合物發(fā)生水解。常用的無機酸為鹽酸，酸的用量和濃度、反應(yīng)時間及溫度等條件應(yīng)通過實驗來確定。該方法較簡便、快速，但不適于遇酸不穩(wěn)定的藥物。

2.酶水解

生物體內(nèi)存在一些專一水解綴合物的酶，如葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase)可專一地水解葡萄糖醛酸苷綴合物，硫酸酯酶(sulfatase)可專一地水解硫酸酯綴合物。葡萄糖醛酸苷和硫酸酯為最常見的綴合物種類，故實際應(yīng)用中常用葡萄糖醛酸苷酶－硫酸酯酶的混合酶，在37℃、pH 4.5～5.5的條件下孵育數(shù)小時進行水解。

酶水解專屬性強，條件溫和，不易造成被測藥物或代謝物的降解。雖然酶試劑較貴，水解的時間較長，以及酶制劑帶入的黏液蛋白可能對后續(xù)的分析有干擾，但酶水解法仍為首選的方法。

采用酶水解時要注意減少生物樣品中存在的其他酶對測定結(jié)果的影響;尿液中存在抑制酶的陽離子，水解前應(yīng)先除去。

3.溶劑解

硫酸酯綴合物在用有機溶劑進行萃取的過程中會直接被水解，稱為溶劑解(solvolysis)。該方法的水解條件也較溫和。

值得注意的是綴合物水解后測得的是藥物的總量。如要了解藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為綴合物的量以及綴合物占排出藥物總量的比率時，則需直接測定綴合物的含量。

2.2.2.3　有機破壞

生物樣品中的微量金屬和非金屬元素通常以有機結(jié)合狀態(tài)存在，對其進行測定時，通常要將有機物分解，使待測組分轉(zhuǎn)變成易于測定的無機化合物或單質(zhì)，然后進行測定。常用的有機破壞法可分為濕法破壞和干法破壞兩種類型。主要用于毛發(fā)、血、尿、組織等生物樣品中無機金屬元素的測定。

1.濕法破壞

將生物樣品置于消解液中，經(jīng)加熱處理(一般溫度需≥150℃)，生物介質(zhì)被氧化破壞游離出待測組分。常用的消解液為硝酸或以硝酸為主的混合酸，鹽酸、氫氧化鈉、過氧化氫等也可作為消解液。常用的加熱方式為電熱消化器法、電熱板消化法和烘箱消化法。

2.干法破壞

本法系將生物樣品經(jīng)高溫?zé)胱苹蛉紵茐?，待生物介質(zhì)灰化、揮發(fā)后，取適當(dāng)試劑將待測物溶解或轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定形式，再進行下一步處理。含氮雜環(huán)類化合物用濕法破壞時不易破壞完全，宜選用干法灼燒進行破壞。

傳統(tǒng)的濕法破壞和干法破壞操作時間長，揮發(fā)性元素易損失。近年來，一種新的有機破壞方法——微波消解法在生物樣品制備中得到了一定的應(yīng)用。該法結(jié)合了高壓消解與微波快速加熱兩方面的性能，在密閉容器內(nèi)進行有機破壞。具有操作簡便、溶劑用量少、消化完全、無元素?fù)p失及多元素測定的優(yōu)點。

2.2.2.4　游離藥物的分離

在藥物蛋白結(jié)合率測定及游離藥物的治療藥物監(jiān)測中，常需將游離藥物與蛋白結(jié)合藥物分離。利用游離藥物與結(jié)合藥物分子量差異較大的特點可采用膜分離法或超離心法、凝膠過濾法等方法進行分離。常用的膜分離法包括平衡透析法(equilibrium dialysis)和超濾法(ultrafiltration)。兩種方法均采用半透膜作為分離介質(zhì)，通常所選半透膜的截留分子量為10000～30000 Da。平衡透析法為一種靜態(tài)的分離模式，而超濾法需在3000～10000 r·min－1下離心5～15 min。由于超濾過程中血漿水分逐漸過濾除去，使血漿蛋白的濃度不斷增加，可能影響藥物的蛋白結(jié)合率，因此蛋白結(jié)合率的測定常用平衡透析法。

2.2.2.5　常用的提取純化技術(shù)

經(jīng)去除蛋白質(zhì)、綴合物水解及有機破壞的生物樣品中仍然存在大量的內(nèi)源性雜質(zhì)，需要進一步提取純化。常用的提取純化方法主要有液－液萃取技術(shù)和固相萃取技術(shù)。

1.液－液萃取技術(shù)

液－液萃取(liquid－liquid extraction，LLE)是利用不同組分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)不同，來達到分離、提取或凈化的目的。多數(shù)藥物屬于親脂性的化合物，在有機溶劑中的溶解度大于水中的溶解度;而生物樣品中含有的大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強極性的水溶性物質(zhì)。因而用有機溶劑提取一次即可除去大部分雜質(zhì)，操作簡便，重復(fù)性好。

影響液－液萃取的因素包括:有機溶劑的種類、有機相與水相的容積比、提取的次數(shù)、水相的pH及離子強度等。

(1)有機溶劑的種類:有機溶劑的選擇直接影響液－液萃取的效率和選擇性。理想的有機溶劑應(yīng)滿足下列條件:①對待測成分有大的親和力;②與水不相混溶;③沸點低，易揮發(fā);④化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和惰性;⑤無毒、不易燃燒;⑥不易產(chǎn)生乳化;⑦不影響后續(xù)的檢測。但在實際應(yīng)用中，上述條件往往不能全面兼顧，只能根據(jù)實際情況擇其重要條件進行選擇。較高的提取率和提取的重復(fù)性是選擇的重要依據(jù)。液－液萃取常用的有機溶劑見表2－2。

表2－2　液－液萃取常用有機溶劑

續(xù)表2－2　

乙醚、三氯甲烷和二氯甲烷等溶劑萃取能力強、又易于揮發(fā)、富集，為常用的提取溶劑，也可用混合溶劑提取。乙醚在水中有一定的溶解度，選用乙醚作提取溶劑時，應(yīng)在提取前加入適量的中性鹽(如固體氯化鈉)以減少乙醚中的含水量，或在乙醚萃取液中加無水碳酸鈉脫水，以減少水溶性雜質(zhì)的干擾。

(2)有機相與水相的容積比及提取次數(shù):生物樣品中藥物的濃度一般較低，用大量的溶劑提取會進一步稀釋藥物的濃度，不利于檢測。故有機溶劑的用量和次數(shù)不可過多，只要保證提取率＞50%且穩(wěn)定即可。一般有機相與水相的容積比為1 1或2 1，且只提取1次，最多不超過2次。

(3)水相的pH:水相的pH直接影響弱酸、弱堿性藥物的電離狀態(tài)，一個合適的水相pH是保證高提取率的前提。當(dāng)水相pH與藥物的pKa值相等時，有50%的藥物以非電離形式存在;當(dāng)水相pH低于酸性藥物的pKa值2～3個單位，或水相pH高于堿性藥物的pKa值2～3個單位時，有99.0%的藥物以非電離形式，易被有機溶劑提取。因此水相pH選擇的基本原則是:堿性藥物在堿性條件下提取;酸性藥物在酸性條件下提取;由于內(nèi)源性雜質(zhì)偏酸性，中性化合物一般在偏堿性條件下提取。為了獲得可重復(fù)的提取率，水相中需加入合適的緩沖溶液來穩(wěn)定水相的pH。

(4)離子強度:加入一定量的中性鹽(如氯化鈉)，可以增加水相的離子強度，降低藥物在水中的溶解度，利于提取。同時中性鹽的加入可減少提取時的乳化現(xiàn)象。

液－液萃取技術(shù)的缺點是需要消耗大量有毒有害的有機溶劑、繁瑣費時、提取過程中易發(fā)生乳化現(xiàn)象、不適于提取強極性或多電荷藥物、難以實現(xiàn)自動化等。近年來，各種新型的液－液提取技術(shù)不斷出現(xiàn)，在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用也在不斷增加。液－液萃取新技術(shù)將在“2.2.3生物樣品預(yù)處理新技術(shù)”中簡單介紹。

2.固相萃取法

固相萃取法(solid－phase extraction，SPE)是利用色譜理論，取裝有不同填料(具有吸附、分配及離子交換性質(zhì)的擔(dān)體)的小柱進行生物樣品制備的技術(shù)。其原理是利用含藥生物樣品溶液流經(jīng)萃取小柱時，由于藥物和干擾組分與填料的作用力有差異，從而使藥物被選擇性地保留或洗脫，達到提取純化和富集的目的。與LLE比較，SPE具有明顯的優(yōu)勢:不存在乳化現(xiàn)象，回收率高，選擇性強，分離時間短，有機溶劑用量少，易于自動化等。固相萃取已成為體內(nèi)藥物分析中最常用的前處理方法。

(1)固相萃取柱的選擇:SPE的填料種類繁多，可分為親脂型(化學(xué)鍵合硅膠、大孔樹脂)、親水型(硅藻土、硅膠和棉纖維)和離子交換型三類。不同類型的填料提高了固相萃取的選擇性，其中十八烷基硅烷鍵合硅膠(簡稱C18)最常用。待測組分的理化性質(zhì)、生物樣品溶液的體積及待測組分的含量是固定相選擇的依據(jù)。首先根據(jù)待測組分的溶解性質(zhì)、是否帶電荷等理化性質(zhì)來選擇填料的種類，并通過預(yù)試找出最適合的柱填料。然后根據(jù)被萃取物的量來選擇填料量的規(guī)格，一般被萃取物的量不得超過填料量的5%。如柱填料為100 mg的固相柱，被萃取物的量應(yīng)不大于5 mg。最后根據(jù)生物樣品的體積來選擇固定相的柱體積，一般柱體積應(yīng)大于樣品溶液的體積，比如2 mL的樣品溶液可選用3 mL體積的固相柱。

近年來，SPE填料的種類與數(shù)目迅速擴大，使固相萃取技術(shù)在生物樣品制備中的應(yīng)用越來越廣泛。為了保證萃取結(jié)果的重現(xiàn)性，實際應(yīng)用中大都選擇商品化的固相萃取小柱(示意圖見圖2－4)。

圖2－4　固相萃取小柱示意圖

(2)生物樣品溶液的前處理:固相填料的粒度一般為40～80μm，含有大顆粒雜質(zhì)的生物樣品可能會堵塞柱子，因此含有蛋白質(zhì)的血液樣品和組織樣品在進行SPE制備之前最好先進行沉淀蛋白處理。尿液、細(xì)胞培養(yǎng)液等一般無需處理即可進行固相萃取，但若含有顆粒則需經(jīng)離心處理。另外，根據(jù)藥物的理化性質(zhì)及與填料的作用力特點，需通過適當(dāng)處理(如調(diào)節(jié)樣品溶液的pH)將藥物轉(zhuǎn)化成便于吸附或洗脫的形式。如堿性藥物選用C18化學(xué)鍵合硅膠小柱進行預(yù)處理時，需將生物樣品溶液的pH調(diào)至堿性，使藥物呈游離狀態(tài)，易于被C18化學(xué)鍵合硅膠吸附。

(3)固相萃取步驟:以C18化學(xué)鍵合硅膠小柱的一般操作為例。

第一步:柱活化。為了保證萃取率的重現(xiàn)性，小柱必須用適當(dāng)?shù)娜芤哼M行活化處理。對于C18柱，首先用柱填料6～8倍體積的甲醇來活化，可達兩個目的:一是展開碳?xì)滏?，增加填料與待測組分作用的表面積;二是除去填料中吸附的雜質(zhì)。然后用6～8倍體積的水或緩沖液洗去多余的甲醇，因為C18柱在甲醇含量約8%的水溶液中才能保持濕潤，從而有利于藥物的吸附。

第二步:上樣。取已處理的生物樣品溶液按照一定速度經(jīng)過小柱，棄去廢液。

第三步:柱洗滌。用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱，棄去洗液，除去與填料無作用或作用弱的內(nèi)源性物質(zhì)和其他干擾物質(zhì)。

第四步:洗脫。選擇合適的洗脫溶劑洗脫待測組分，收集洗脫液以備后用。洗脫劑的洗脫能力要足夠，單一種類溶劑洗脫能力不足時，可用混合溶劑;另外洗脫溶劑的用量不可太大，如需濃縮盡可能選擇沸點較低的有機溶劑。

固相萃取基本步驟示意圖見圖2－5。

圖2－5　固相萃取基本步驟示意圖

(4)注意事項:在整個固相萃取過程中，固相柱都需保持濕潤，以免影響提取效率;樣品量應(yīng)控制在固相柱的有效裝載量內(nèi)(一般為填料質(zhì)量的1%～5%)，填料的吸附會飽和，過載會造成回收率下降;流速要控制，太快待測成分與填料不能充分接觸，使分離度下降、待測成分流失、重復(fù)性差，一般活化和洗滌時的流速為5～10mL·min－1，上樣和洗脫時的流速以0.2～1 mL·min－1為宜。

(5)固相萃取法的缺點:商品化的固相萃取小柱為一次性耗材，使用成本高;對操作技術(shù)要求較高;不同批次小柱的提取率有差異;柱子易堵塞，一般樣品需進行預(yù)處理。

(6)自動化固相萃取:固相萃取法中，人工操作易引入較大的誤差，可通過采用自動化的固相萃取裝置(市售自動化固相萃取儀見圖2－6)來降低預(yù)處理過程中的誤差。同時自動化固相萃取裝置易與分析儀器(如HPLC、CE等)聯(lián)用實現(xiàn)在線分析。

2.2.2.6　富集

經(jīng)過提取純化，尤其經(jīng)液－液萃取法，提純后的待測成分被轉(zhuǎn)移至較大體積的有機溶劑中，雖然得到了純化，但濃度往往較低，達不到分析方法的檢測靈敏度，還不能直接進行分析，常需將被測組分富集后再進行測定。富集的方法主要有兩種:一種是在末次提取時加入盡量少的提取液(數(shù)毫升)，提高待測成分的濃度;另一種是揮干溶劑，然后再用適于后續(xù)分析方法的小體積溶劑復(fù)溶。實際操作中，后一種方法的應(yīng)用較多。但揮干溶劑時應(yīng)避免直接加熱，防止被測組分破壞或損失。常用揮干溶劑的方法是直接通入氮氣流和空氣流吹干，也可適當(dāng)加熱。對于易隨氣流揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定的藥物，可采用減壓法揮去溶劑。

圖2－6　GX－271 ASPEC自動固相萃取儀

2.2.2.7　衍生化

大部分藥物經(jīng)預(yù)處理后可直接進行分析，但一些極性較大、揮發(fā)性差、穩(wěn)定性差，或不具紫外、熒光性能，檢測靈敏度低的藥物則需進行衍生化處理。如在GC分析中，一般要求藥物具有揮發(fā)性，對熱穩(wěn)定等，對于揮發(fā)性差、對熱不穩(wěn)定的藥物則需進行化學(xué)衍生化。HPLC法通過衍生化處理，可以達到提高藥物檢測的靈敏度，增強藥物的穩(wěn)定性，改善分離效果等目的。此外，手性藥物的拆分常采用手性試劑衍生化法，將對映體轉(zhuǎn)變成非對映異構(gòu)體后用常規(guī)色譜法進行分析。

氣相色譜法常用的衍生化反應(yīng)有硅烷化、烷基化、?；?、酯化、鹵代衍生化等。其中硅烷化是應(yīng)用最廣泛的方法之一。藥物分子中的羥基、氨基、羧基、巰基等極性基團中的活潑氫均可被硅烷基取代，使藥物變成極性低、易揮發(fā)和熱穩(wěn)定性好的硅烷基衍生物。?；饕糜诎被衔锏难苌幚?，也可用于羥基、巰基化合物的衍生化。酯化主要用于含羧基化合物的衍生化處理，可提高有機酸的揮發(fā)性。鹵化衍生物能采用靈敏度較高的電子捕獲檢測器，提高藥物的檢測靈敏度，同時也可改善藥物的揮發(fā)性和穩(wěn)定性。常用的GC衍生化試劑包括硅烷化試劑:三甲基氯硅烷、雙－三甲基硅烷乙酰胺、雙－三甲基硅烷三氟乙酰胺、三甲基硅烷咪唑等;烷基化試劑:碘甲烷、疊氮甲烷、氫氧化三甲基苯胺等;酰化試劑:乙酸酐、丙酸酐等。

拆分光學(xué)異構(gòu)體時需用到不對稱試劑，常用的不對稱試劑有:三氟乙酰脯胺酰氯、五氟乙酰脯胺酰氯等。

采用HPLC法時，衍生化的目的主要是為了提高藥物的檢測靈敏度。鄰苯二醛、熒胺等常用的衍生化試劑適用于氨基酸、肽類藥物;丹磺酰氯、異氰酸、β－萘酯等適用于含有胺基、酚羥基、羧基、巰基的藥物。

按衍生化反應(yīng)與色譜分離的時間前后，HPLC化學(xué)衍生化法可分為柱前衍生化和柱后衍生化兩種方法。柱前衍生化的優(yōu)點是衍生化條件較寬松，不受色譜系統(tǒng)的限制，也不需附加的儀器設(shè)備。由于柱前衍生化法是取未分離的樣品與衍生化試劑反應(yīng)，故具有相同官能團的藥物和雜質(zhì)均會發(fā)生衍生化反應(yīng)，產(chǎn)生干擾組分;且衍生化反應(yīng)率較低。因此，應(yīng)盡可能將樣品進行精制后再衍生化，操作較繁瑣。柱后衍生化是藥物經(jīng)色譜柱分離之后，即刻與衍生化試劑反應(yīng)，生成的衍生物進入檢測器檢測。為了保證流出柱后的藥物衍生化反應(yīng)完全，在測定過程中必須使衍生化試劑處于流動狀態(tài)，以便及時與藥物接觸，這需要附加儀器設(shè)備。兩類方法中柱后衍生化法更適合于連續(xù)的自動化分析。究竟選用哪種方法，需視不同情況而定。