第八節(jié)　血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)

血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)是以血紅蛋白為先導(dǎo)，已經(jīng)在多種遺傳并檢測(cè)、產(chǎn)前診斷和攜帶者檢查中發(fā)揮作用。自采用分子雜交技術(shù)成功地進(jìn)行了ɑ-地中海貧血的基因診斷以來(lái)，基因診斷技術(shù)迅速發(fā)展，如PCR技術(shù)、DNA測(cè)序技術(shù)、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性、轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因芯片技術(shù)等，成果累累。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，推動(dòng)了 后基因計(jì)劃—蛋白質(zhì)基因組學(xué)和細(xì)胞組學(xué)的發(fā)展，造血細(xì)胞與非造血細(xì)胞之間的關(guān)系分子又是血液病基因診斷的一項(xiàng)新內(nèi)容，細(xì)胞與蛋白質(zhì)的關(guān)系依賴于遺傳基因。因此，積陰德表達(dá)、細(xì)胞之間和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)、特異的血液病的基因或融合基因的檢測(cè)將是血液分子檢驗(yàn)的主要內(nèi)容和方向?？梢娧悍肿由飳W(xué)檢驗(yàn)在血液疾病的基因分析、診斷、分型、指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后和微小殘留病灶的檢測(cè)等方面起著重要作用。

一、核酸分子雜交技術(shù)

1.Sonthern印跡雜交　是一種常用于分析DNA結(jié)構(gòu)的雜交技術(shù)。由Sonthern印跡和分子雜交兩部分組成。待測(cè)的基因DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化后，酶解片斷經(jīng)瓊脂凝膠電泳，將DNA片斷按分子大小分開，在將其從凝膠中印跡到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，以放射性或非放射性標(biāo)記的DNA探針與固相支持上的DNA雜交，根據(jù)探針的標(biāo)記特性用相應(yīng)的方法顯示雜交帶，對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行分析。

2.northern印跡雜交　是一種常用于分析DNA結(jié)構(gòu)的雜交技術(shù)。待測(cè)RNA經(jīng)變性及瓊脂糖電泳分離后，RNA分子按大小不同相互分開，隨后將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后用DNA或RNA探針雜交，按探針的標(biāo)記特性對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)待測(cè)RNA進(jìn)行分析。

3.核酸原位雜交　以放射性或非放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針在組織、細(xì)胞及染色體上與其相關(guān)的核酸序列雜交，由于非放射性標(biāo)記探針具有前述優(yōu)點(diǎn)以及在原位雜交中具有穩(wěn)定性好，顯色快及易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)應(yīng)用普遍。其中熒光原位雜交技術(shù)將生物素標(biāo)記的探針與中期或間期染色體雜交，通過(guò)間接免疫熒光法使信號(hào)放大，染色體顯帶后用IP染色，根據(jù)FITC/PT的激發(fā)一發(fā)射光波長(zhǎng)，選擇熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，染色體顯紅色，染色體上特異雜交帶顯黃綠色。中期染色體的原位雜交可用于基因定位、基因缺失、基因易位及融合基因的檢測(cè)。在分裂象細(xì)胞數(shù)目量少或重量差時(shí)，間期細(xì)胞的原位雜交可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行分析，對(duì)于檢測(cè)染色體異常、腫瘤致病基因和腫瘤微小殘留病灶有廣闊的發(fā)展前景。

二、聚合酶鏈反應(yīng)

1.原理　PCR是一種模擬天然DNA合成過(guò)程的選擇性體外擴(kuò)增方法。在加熱條件下，DNA變性，螺旋解開，在退火條件下，引物與模板DNA結(jié)合，在TaqDNA聚合物、鎂離子及合適的pH的緩沖液存在的條件下。引物延伸過(guò)程第二輪PCR反應(yīng)。把基因拷貝由2個(gè)增至4個(gè)。在反應(yīng)的初期原來(lái)的DNA起模板的作用。隨著循環(huán)數(shù)的遞增。由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板。重復(fù)上述過(guò)程20～30個(gè)循環(huán)，就可以把基因拷貝數(shù)以指數(shù)形式增加上百萬(wàn)倍，從而達(dá)到體外擴(kuò)增核酸序列的目的。

2.PCR產(chǎn)物分析

（1）瓊脂糖凝膠電泳：在PH8.0時(shí)，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)鐘向正極移動(dòng)，其移動(dòng)的速率與分子的大小成反比。待分離的PCR產(chǎn)物中要加入溴化乙啶，在紫外燈下觀察電泳條帶時(shí)，溴化乙啶與DNA結(jié)合后，發(fā)出棕紅色的熒光。

（2）sonthern印跡雜交：將瓊脂糖凝膠電泳分離的PCR產(chǎn)物在原位變性，并將變性產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或尼龍膜上，然后用生物素等標(biāo)記探針檢測(cè)該產(chǎn)物。

（3）斑點(diǎn)雜交法：當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物是多條帶紋時(shí)，用斑點(diǎn)雜交法分析PCR產(chǎn)物首先將擴(kuò)增的片段固定在硝酸纖維素或尼龍膜上，然后用生物素等標(biāo)記探針雜交，將不同的探針固定在同一尼龍膜上，用標(biāo)記的PCR產(chǎn)物作探針雜交，根據(jù)雜交點(diǎn)的位置即可判斷產(chǎn)物序列變異的種類。點(diǎn)雜交有助于遺傳病的基因診斷，還可用于基因多態(tài)性分析。

（4）PCR-ELISA法：待測(cè)的PCR產(chǎn)物需攜帶有生物素等固定集團(tuán)和PCR地高辛等檢測(cè)集團(tuán)。這可通過(guò)將PCR反應(yīng)中的兩個(gè)引物5^，端分別標(biāo)記生物素和地高辛來(lái)實(shí)現(xiàn)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物中帶生物素標(biāo)記的引物延伸鏈與帶地高辛的引物延鏈形成雙鏈，生物素等固定集團(tuán)可與微孔板上包被的親和素結(jié)合，向微孔板中加入酶標(biāo)記的地高辛抗體和生色底物，即對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行ELISA分析。

（5）原位雜交法：PCR產(chǎn)物并可用原位雜交法檢測(cè)，所用探針可用生物素、地高辛或熒光標(biāo)記。

三、基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)又稱DNA微陳列，基因芯片技術(shù)已成為21世紀(jì)生命科學(xué)中應(yīng)用廣泛的一項(xiàng)快速高效的分子生物學(xué)技術(shù)。所謂DNAchip就是固定大量以特定排列方式的基因探針或基因片段的硅片，玻片和塑料片，樣品DNA/RNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，與微陳列雜交后再通過(guò)熒光掃描儀及計(jì)算機(jī)分析，即可獲得樣品大量基因序列及表達(dá)信息。DNAchip應(yīng)用廣泛，現(xiàn)在主要用于病原檢測(cè)、細(xì)胞的基因表達(dá)檢測(cè)、疾病相關(guān)基因突變及單核苷酸多態(tài)分析等。

四、臨床評(píng)價(jià)

分子生物學(xué)的發(fā)展推動(dòng)了血液分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等細(xì)胞進(jìn)行分子水平的基礎(chǔ)研究，不斷地從分子水平闡明造血功能及分子調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)胞因子及其受體分子結(jié)構(gòu)，促凝和抗凝因子及纖維蛋白系統(tǒng)的機(jī)構(gòu)和功能關(guān)系，抗原受體基因的重排等。血液分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究為血液病基因診斷提供了依據(jù)，血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)主要目標(biāo)也是對(duì)血液病基因診斷。體細(xì)胞基因突變可引起各種遺傳學(xué)血液病，如α-珠蛋白基因的缺陷造成的α-地中海貧血；凝血因子VIII基因的點(diǎn)突變，缺失和插入，導(dǎo)致甲型血友??；基因的擴(kuò)增、基因點(diǎn)突變、基因重排及基因融合的形成常引起惡性血液病如白細(xì)胞和淋巴瘤的發(fā)生?？梢娧悍肿由飳W(xué)檢驗(yàn)在血液疾病的基因分析、診斷、分型、指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后和微小殘留病灶檢測(cè)等方面有重要作用。

1.惡性血液病融合基因的檢測(cè)

（1）慢性粒細(xì)胞白細(xì)胞bcr-abl融合基因：應(yīng)用傳統(tǒng)的southern印跡雜交法，以BCR為探針，發(fā)現(xiàn)所有ph陽(yáng)性的慢粒均有該基因的重組，而多數(shù)ph陰性的慢粒也有bcr-abl基因重組。由于PCR方法靈敏、快速，目前多采用逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR法來(lái)檢測(cè)慢粒的融合基因，即以待測(cè)mRNA-ABL轉(zhuǎn)錄本為模板，用逆轉(zhuǎn)錄酶合成bcr-abl接頭部順序的Cdna，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。目前采用FISH法對(duì)染色體原位檢測(cè)bcr-abl也是有效的方法。

（2）急性早幼粒細(xì)胞性白血病PML-RARA融合基因：通過(guò)southern印跡雜交，RT-PCR及FISH法進(jìn)行檢測(cè)。也有少數(shù)患者無(wú)t（15；17），而有PML-RARA融合。少數(shù)患者，細(xì)胞遺傳學(xué)檢查為t（11；17）或t（5；17）經(jīng)分子水平檢測(cè)分別為PLZF-RARa和NPM-RARa融合基因，或有更復(fù)雜的染色體易位。

2.免疫球蛋白重鏈（IgH）基因和T細(xì)胞受體基因重排的內(nèi)測(cè)　IgH和TCR的編碼基因具有多態(tài)性。IgH基因重排是產(chǎn)生抗體多樣性和獨(dú)特性的重要原因。由于白血病細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞，所以白血病細(xì)胞是單克隆性的。用PCR方法對(duì)重排基因進(jìn)行擴(kuò)增，正常白細(xì)胞的擴(kuò)增產(chǎn)物大小不等，呈模糊的階梯狀。而白血病細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后條帶是單一的。約80%的B淋巴細(xì)胞性白血病可檢測(cè)到IgH基因重排。通過(guò)PCR方法檢測(cè)IgH和TCR基因重排，有助于急性淋巴細(xì)胞白血病的分型及微小殘留病灶病的檢測(cè)。

3.遺傳血液病的診斷　血紅蛋白病常見的遺傳性溶血性疾病，血友病是常見的遺傳性出血性疾病?；蛉毕莅ɑ蛉笔?、點(diǎn)突變、插入、倒立等。對(duì)于基因重排，可通過(guò)PR-PCR進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)于點(diǎn)突變可用PCR結(jié)合酶切位點(diǎn)分析，即當(dāng)點(diǎn)突變使某一酶切位點(diǎn)消失或在某一區(qū)域出現(xiàn)新的酶切位點(diǎn)時(shí)，可用該酶切點(diǎn)二側(cè)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶切割，根據(jù)電泳圖譜來(lái)判斷有無(wú)內(nèi)切酶的改變。對(duì)于與限制性內(nèi)切酶點(diǎn)無(wú)連鎖的點(diǎn)突變則可以采用PCR結(jié)合特異寡核苷酸探針斑點(diǎn)雜交法進(jìn)行診斷。

4.HLA基因多態(tài)性檢測(cè)　采用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的反向雜交，十分簡(jiǎn)便。將每個(gè)位點(diǎn)的所有寡核苷酸探針固定在固相支持物上，引物先經(jīng)生物素化后，進(jìn)行待測(cè)DNA的基因擴(kuò)增，從而得到生物素化的DNA擴(kuò)大產(chǎn)物。用此產(chǎn)物與膜上的探針雜交，然后進(jìn)行染色或化學(xué)發(fā)光。這樣每個(gè)標(biāo)本只需雜交一次即可完成。此方法用于骨髓移植的HLA基因配型及HLA基因與疾病的相關(guān)性分析。

5.腫瘤細(xì)胞多耐藥性基因的檢測(cè)　耐藥性（MDR）是指腫瘤細(xì)胞接觸了一種藥物后，不但對(duì)該藥產(chǎn)生了耐藥性，而且對(duì)其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的藥物也產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，MDR的出現(xiàn)與多耐藥基因過(guò)度表達(dá)有關(guān)，目前已建立northern印跡法、斑點(diǎn)和狹縫印跡法、PR-PCR法及原位雜交法，從mRNA水平對(duì)患者進(jìn)行測(cè)定，了解腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

6.基因治療　基因治療的目的是應(yīng)用DNA重排技術(shù)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，把野生型的基因?qū)牖颊唧w細(xì)胞中，合成為正常的基因產(chǎn)物，來(lái)彌補(bǔ)缺陷基因的功能，從而使疾病得到糾正。目前認(rèn)為基因治療的靶細(xì)胞是造血干細(xì)胞或間質(zhì)干細(xì)胞等。常用的載體是逆轉(zhuǎn)病毒和腺病毒。采用含人因子Ⅸ基因逆轉(zhuǎn)病毒載體轉(zhuǎn)染血友病B患者的原代皮膚成纖維細(xì)胞，使其表達(dá)一定濃度的因子Ⅸ，這將為血友病B治療提供新的方法。