一、目的要求

認識植物病原細菌的形態(tài)和菌齡特征，學(xué)習(xí)并掌握細菌鞭毛染色的原理及方法，比較鞭毛染色制片過程與革蘭氏染色涂片法的差異，熟悉菌體鞭毛數(shù)目及著生位置與細菌分類鑒定的關(guān)系。

二、材料和用具

（一）實驗材料

1.供試菌種

白菜細菌軟腐病菌或甘藍黑腐病菌。 供試菌種必須在使用前5d移植，臨用前18~24h再轉(zhuǎn)試管1次，以保證菌體處于分裂活躍時期。

2.染液

（1）媒染液A

10%的單寧酸10m L，加5m L飽和硫酸鋁鉀水溶液，再加1m L苯胺飽和水溶液形成沉淀，通過搖動又能重新溶解，加入5%的Fe Cl3水溶液1m L形成黑色溶液，穩(wěn)定10min后使用。

（2）銀染液B

配制5%的Ag NO3水溶液100m L，取10m L備用，在緩慢加入氨水形成的沉淀剛好重新溶解時，把備用的10m LAg NO3水溶液向其中逐滴加入，直到搖動后呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀溶液為止，避光保存。

（二）實驗用具

接種環(huán)、無菌水、顯微鏡、吸水紙、清潔試管、鑷子、清潔無脂載玻片、脫脂棉、草紙、裝有酒精的試管、酒精燈等。

三、內(nèi)容和方法

（一）實驗原理

細菌的鞭毛極細，直徑一般為10~20nm，只有用電子顯微鏡才能觀察到。 但是如果采用特殊的染色法對其進行染色，則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看得到。 鞭毛的染色方法很多，但其基本原理都相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。 常用的媒染劑由單寧酸和氯化鐵或鉀明礬等配制而成。

（二）鍍銀法染色

1.載玻片的準備

選擇光滑無裂痕的載玻片（最好選用新的）。

2.菌懸液的制備

供試菌株接種培養(yǎng)18~24h，用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數(shù)環(huán)，移至盛有1~2m L無菌水的試管中，使菌液呈輕度混濁。 將該試管放在37℃恒溫箱中靜置10min，讓幼齡菌的鞭毛舒展開。

3.涂片

吸取少量菌液滴在清潔載玻片的一端，立即將載玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液。 涂片放在空氣中自然干燥。

4.染色

（1）滴加A液，染色4~6min；

（2）用蒸餾水充分洗凈A液；

（3）用B液沖去殘水，再加B液于載玻片上，在酒精燈火焰上加熱至有蒸汽產(chǎn)生，維持0.5~1min（加熱時應(yīng)隨時補充蒸發(fā)掉的染料，不可使載玻片出現(xiàn)干涸區(qū)）；

（4）用蒸餾水洗凈，自然干燥。

5.鏡檢

先用低倍鏡，再用高倍鏡，最后用油鏡觀察。

結(jié)果：菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。

（三）注意事項

1.染液要現(xiàn)配現(xiàn)用，不能長時間保存。

2.細菌鞭毛極細，很易脫落，在整個操作過程中，必須仔細小心，以防鞭毛脫落。

3.染色用載玻片干凈無油污是鞭毛染色成功的先決條件。

4.油鏡使用之后要及時用無水乙醇清洗鏡頭。

四、實驗學(xué)時

3學(xué)時。

五、作業(yè)與思考題

1.每人交檢測玻片1~2片，并完成實驗報告1份。

2.細菌鞭毛染色具有什么意義？

3.鞭毛染色中細菌的培養(yǎng)時間為什么不能超過24h？

4.細菌鞭毛染色過程中應(yīng)當注意什么問題？