對于植物病害的防控，相較于使用化學(xué)藥劑、農(nóng)業(yè)防治，選育抗病品種具有綠色無污染、簡便易行等優(yōu)點，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上已有許多成功的應(yīng)用案例。 抗病品種的選育是以寄主品種的抗病性鑒定為依據(jù)的。

一、目的要求

本實驗重點學(xué)習(xí)小麥條銹病接種和抗性鑒定方法。 小麥條銹病的接種方法很多，有涂抹法、噴粉法、噴霧法、注射法等。 又因接種鑒定的時期不同，分為幼苗鑒定和成株鑒定。

二、材料和用具

（一）實驗材料

小麥盆栽幼苗、小麥條銹病菌（Puccinia striiformis）菌種。

（二）實驗用具

接種針、毛玻璃、小噴霧器、噴粉器、滴瓶、保濕桶、鉛筆、指形管、酒精、塑料薄膜（或玻璃）、滑石粉、注射器等。

三、內(nèi)容和方法

（一）抗病性鑒定的原理

抗病性鑒定是抗病育種的重要基礎(chǔ)，從抗原篩選、后代選擇直到品種推廣，全過程都離不開抗病性鑒定。 狹義的抗病性鑒定是評價寄主品種、品系或種質(zhì)對特定病害的抵抗力或感染程度。 廣義的抗病性鑒定還應(yīng)包括病原物的致病性評價。 鑒定方法包括自然鑒定、接種鑒定、田間成株鑒定、室內(nèi)苗期鑒定、離體鑒定及間接鑒定等。 在實際工作中則需根據(jù)植物、病害種類，目的要求和設(shè)備條件而定。

1.田間自然鑒定

自然發(fā)病條件下的田間鑒定是鑒定抗病性的最基本方法，尤其是在各種病害的常發(fā)區(qū)，進行多年、多點的聯(lián)合鑒定是一種有效方法。 它能對育種材料或品種的抗性進行最全面、最嚴格的檢驗。 田間鑒定的方法因植物種類而異，大田作物的田間鑒定一般要進行人工接種，而接種方法又因病菌而異。對棉花黃萎病等土傳病害，除在重病地設(shè)立自然病圃外，在非病地設(shè)立人工病圃時，必須將事先培養(yǎng)的菌種在播種或施肥時一起施入，以誘發(fā)病害。 對于小麥銹病、玉米大斑病及稻瘟病等氣傳病害，可分別用涂抹、噴霧及注射等方法進行接種，以使具有抗接觸、抗侵入等抗病機制的品種也得以發(fā)病。

病圃的設(shè)置與利用是進行抗病性鑒定的基本條件，沒有嚴重而均勻的發(fā)病條件，就難以對植物品種資源的抗病性做出可靠的鑒定。 按照病圃發(fā)生病害種類的不同，病圃可分為單一病圃和多種病害混生病圃。 單一病圃的優(yōu)點是可以避免多種病害的干擾，有利于鑒定不同品種資源對不同病害的抗病性，同時也是選育單抗品種的必要條件；而多種病害混生病圃的優(yōu)點是可在較短時間內(nèi)選育或鑒定具有兼抗或多抗性的材料。

2.溫室或田間接種鑒定

這種方法是將病原菌孢子或病毒直接接種到溫室或田間植株的葉片、果實或根上，它適合對所有植物進行抗病性鑒定。 由于抗病現(xiàn)象是寄主、病原物及環(huán)境條件三者共同作用的結(jié)果，因此，這種鑒定結(jié)果也能真實地反映被鑒定材料的抗病性，可靠性強。

接種鑒定的技術(shù)規(guī)程包括育苗、接種體的制備（病菌的分離、保存與孢子誘發(fā)）及接種三個環(huán)節(jié)，接種的方法有點滴法、噴霧法、浸根法、摩擦法及注射法等。 葉片及果實接種，適宜選用點滴法或噴霧法。 而土傳病菌，如黃瓜枯萎病菌可采用孢子懸浮液浸根法進行接種。 接種材料的發(fā)育程度及接種孢子濃度（選擇壓）等因素都會影響鑒定的效果，因此這些因素要通過試驗以便確立最佳方案。

3.離體接種鑒定

從植物植株上取下子葉、葉片或果實進行離體接種鑒定，可鑒定那些以組織、細胞或分子水平的抗病機制為主的病害，如馬鈴薯晚疫病、小麥白粉病及煙草黑脛病等。 離體鑒定具有操作簡便、鑒定結(jié)果可靠等優(yōu)點，可同時分別鑒定同一材料對不同病原菌的抗性，而不影響幼苗正常生長發(fā)育和開花結(jié)實。

鑒定方法不僅因植物、病菌種類而異，而且抗病性分級標準也因作物、病原菌的種類不同而存在很大的差別。 白菜霜霉病的病情分級標準（表22-1）和葡萄白粉?。ㄌ镩g自然鑒定）的病情分級標準（表22-2）如下。

表22-1 白菜霜霉病病情分級標準

表22-2 葡萄白粉病病情分級標準

病情指數(shù)反映了病害的普遍率和嚴重程度，指數(shù)越大，說明病情越嚴重，寄主的抗病性越差；指數(shù)越小，說明病情越輕，寄主的抗病性越強。

根據(jù)病情指數(shù)，可將植物對一些病害的抗病性進行分類，其中白菜霜霉病等病害適用下列標準。

表22-3 植物對白菜霜霉菌抗性分類標準

小麥銹病流行地區(qū)廣，造成的產(chǎn)量損失大，一般會導(dǎo)致減產(chǎn)25%~75%，在某些地區(qū)這甚至是限制小麥生產(chǎn)的主要因素。 選育和栽培抗銹品種是防治小麥銹病危害的最根本有效措施。 因此，在小麥育種過程中，必須了解和掌握抗銹性鑒定的方法。

小麥銹病有條銹、葉銹、稈銹三種，由于地區(qū)間生態(tài)條件的差異，銹病發(fā)生的種類不同，而且危害的程度也各異。 我國北方冬小麥區(qū)以條銹病為主，葉銹病、稈銹病次之；春小麥區(qū)則以稈銹病為主。 銹病的發(fā)生受到小麥材料的抗病能力、病原物的致病力和發(fā)病環(huán)境的影響，因此銹病在自然條件下，并非每年每地均嚴重發(fā)生。 在進行抗病育種時，除在發(fā)病的麥田進行直接鑒定外，有時還必須在人工接種環(huán)境下，進行誘發(fā)鑒定。

（二）小麥銹病病菌接種

1.幼苗接種

一般在溫室內(nèi)進行，于麥苗第1片葉子長達40~50mm時接種，等充分發(fā)病后再進行鑒定。 這種方法的好處是可在較短的時間內(nèi)測定大量材料對銹病的抗病性；便于鑒定不同小麥品種對不同銹病生理小種的抗病性；能防止當?shù)匚窗l(fā)現(xiàn)而外地已存在的新的生理小種向外傳播。 幼苗鑒定的接種方法有以下幾種。

（1）涂抹法

此法主要在繁殖少量菌種或接種少量鑒定材料時應(yīng)用。 在接種鑒定前10d左右，將待鑒定的小麥品種的種子，播種于直徑為0.08~0.1m的小花盆內(nèi)。每盆播種2~3個品種，其中一個品種為易感病的誘發(fā)品種，以作對照。各品種要相互隔開，插上標簽，注明品種名稱及播種日期等。 在開始接種前，先從用以繁殖銹病孢子的麥苗上，采集病菌孢子置于小指形管中（注明菌種生理小種號及采集日期），然后從指形管中取出少許銹菌孢子放在潔凈的毛玻璃上，用滴管加入少量水，用接種針將銹菌孢子與水拌勻備用。 另外用潔凈的手指蘸清水或0.1%的吐溫水溶液將麥苗的葉片摩擦數(shù)次，去掉葉片表面的蠟質(zhì)和茸毛，以利于菌液吸附于葉面上。 用消過毒的接種針蘸上調(diào)制好的孢子液，涂抹于麥葉表面進行接種。 一般將條銹、葉銹的孢子接種于葉片的正面，而稈銹病菌則接種于葉片背面為好。 然后記錄并注明接種日期及所用菌種。接種后把麥苗隨即放入保濕桶中（即用1個鐵皮桶，其內(nèi)盛水，保持99%~100%的濕度），再用噴霧器噴降水霧，令麥苗和保濕桶的內(nèi)壁沾滿霧滴，噴霧不能過量，以防沖掉已接種的銹病孢子。 噴霧后，馬上用塑料薄膜或玻璃蓋嚴，把保濕桶放置在適當?shù)臏囟葪l件下。 經(jīng)24h左右，再將麥苗取出，移至陽光充分的溫室內(nèi)，約經(jīng)2周后麥苗即可發(fā)病，此時即可鑒定品種的抗病力。

麥苗接種后，保濕階段要求的最適溫度，條銹為9~13℃，葉銹為15~20℃，稈銹為18~22℃。自保濕桶中取出放入溫室后平均溫度最好分別控制在16~18℃（條銹），18~22℃（葉銹），21~24℃（稈銹）。光照時間每天應(yīng)不少于12h，冬季光照不足，需每天增加一定時間的人工輔助光照。上述的溫度和光照掌握得好壞是發(fā)病充分與否的關(guān)鍵。

在分別接種不同生理小種進行鑒定時，接種用的一切用具都要先進行消毒，防止可能發(fā)生的污染影響鑒定結(jié)果。

（2）噴粉法

小噴粉器經(jīng)消毒、干燥后，加入適量的干燥滑石粉，再加入少量新采集的銹病孢子，混合均勻待用（滑石粉與孢子的比例為20∶1至30∶1）。接種用的銹病孢子應(yīng)事先去除混在其中的雜質(zhì)，以防噴粉時造成噴粉器堵塞。 開始接種前，先將已去除葉片蠟質(zhì)的盆栽麥苗，放入保濕桶內(nèi)，用噴霧器在麥苗上均勻噴上霧滴，隨即用噴粉器將上述稀釋的孢子粉均勻地噴撒到每盆麥苗的葉片上，再用噴霧器噴霧，使麥苗和保濕桶內(nèi)壁都沾上水滴，當水滴不下滴時為宜。 最后蓋上塑料薄膜，保濕階段和以后各項操作及注意事項同前述。

（3）噴霧法

用小型噴霧器將制備好的新鮮孢子懸浮液（在噴霧器內(nèi)，加入要接種的銹病孢子，先用少量清水濕潤后，攪成糊狀，再加入足量的水至淡橘黃色即可）噴在已去蠟質(zhì)的麥苗葉片上，接種后將麥苗放于保濕桶內(nèi)保濕，以后的操作及注意事項同前述。

噴粉法及噴霧法適于對大量材料進行接種鑒定。

2.成株接種

成株接種多在田間進行，其方法是在待鑒定抗病力的品種或育種材料的四周播種高度感染銹病的品種作為銹病鑒定的誘發(fā)行。 為了造成發(fā)病的環(huán)境，以得到可靠的鑒定結(jié)果，常需要在誘發(fā)行每隔一定距離的麥苗上進行人工接種，以造成銹病的發(fā)病中心。 用于接種的銹病孢子應(yīng)是當?shù)亓餍械膬?yōu)勢小種，可以是一個小種，也可以是幾個優(yōu)勢小種孢子混合。 接種的方法如下。

（1）噴粉法

接種前，用手蘸清水將葉片拂擦數(shù)下，以去掉葉片蠟質(zhì)，然后用噴霧器噴上霧滴，用噴粉器將由滑石粉稀釋好的孢子粉噴于麥苗上，再用噴霧器噴上水霧，隨即用小花盆或塑料薄膜覆蓋保濕，歷時24h揭開。 此法多用于麥苗起身前后。

（2）注射法

此法多用于麥苗有一定生長高度的拔節(jié)期。 接種前，應(yīng)配制好孢子懸浮液，配制方法同前，以顯微鏡400倍視野中平均有10~20個銹病孢子為適宜濃度。一般在誘發(fā)行上每隔1m左右選取3~5個單莖分別注射接種。 其方法是用注射器將孢子懸浮液從小麥心葉與其下的展開葉葉鞘相接處以下約10 mm處注射，針頭宜向下傾斜刺入，但不要刺穿，擠壓少量懸浮液，以見到心葉處冒出水珠為度。 孢子一般懸浮于液面，所以孢子懸浮液必須隨用隨攪拌或振蕩。 田間接種注射最好在陰天的傍晚進行。 如天氣干旱，接種后在接種點上澆水1~2次，也可以在接種前或接種后適當灌水，以提高田間濕度，利于銹病孢子萌發(fā)、侵染和發(fā)病。

除上述兩種方法以外，還可以用噴霧法，即將配成的孢子懸浮液噴在誘發(fā)行上進行接種。 接種后為了有利于銹病孢子萌發(fā)、侵染，也要進行保濕。

接種后約2周即可發(fā)病。但成株的抗病性鑒定一般在小麥乳熟期以后、銹病發(fā)展到高峰時進行，每個品種逐個進行調(diào)查記錄。

（三）小麥品種的抗銹性鑒定

1.幼苗鑒定

衡量小麥品種對銹病的抗病和發(fā)病程度，常用到反應(yīng)型（感染型）、嚴重度和普遍率三個指標。 幼苗期鑒定一般考察其反應(yīng)型。 反應(yīng)型是指植株受病菌侵染后的保衛(wèi)性反應(yīng)，可以用過敏性壞死的有無、強弱，孢子堆能否形成，孢子堆的大小、多少等來判斷。小麥品種對條銹菌的反應(yīng)型可分為6級，分級標準如表22-4所示。

表22-4 小麥對條銹病抗性分級標準

2.成株鑒定

（1）反應(yīng)型

同幼苗鑒定。

（2）嚴重度

即病葉上著生孢子堆部分占整個葉片面積的百分率，用于表示病害發(fā)生的嚴重程度。 從理論上講，應(yīng)將小區(qū)內(nèi)的每一葉片都進行統(tǒng)計后取平均值。但在實際工作中，往往因人力不足，而僅采用目測估計法。 總體上目測評定葉片的發(fā)病情況，估計出發(fā)病的嚴重程度（嚴重率）。 目前嚴重率分級標準尚不統(tǒng)一，但多數(shù)采用下表所示的7級分級標準。

表22-5 目前最常采用的嚴重率分級標準

嚴重率（%）＝[Σ（各相應(yīng)病級嚴重率×各病級葉片數(shù)）/調(diào)查病葉葉片總數(shù)]×100%

（3）普遍率

指病害發(fā)生的普遍程度，即發(fā)病葉片數(shù)占調(diào)查總?cè)~片數(shù)的百分率。

普遍率（%）＝（發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)查葉片總數(shù)）×100%

在實際工作中，一般也采用目測估計法進行觀測。 要求較精確鑒定時，可根據(jù)被鑒定材料小區(qū)面積的大小，隨機選取30~60片葉進行觀察記錄。

四、實驗學(xué)時

9學(xué)時。

五、作業(yè)與思考題

1.每人提交實驗報告1份，比較采用不同接種方法的鑒定效果，討論小麥品種抗性差異的實際意義。

2.植物真菌病害抗性鑒定的基本方法有哪幾種？

3.小麥條銹病發(fā)病的有利條件有哪些？在抗病性鑒定時應(yīng)如何保證這些條件？ 銹菌接種時容易出現(xiàn)哪些問題干擾結(jié)果？

4.論述病原菌生理小種鑒定與寄主抗病性鑒定的科學(xué)意義和實踐意義。