一、目的要求

學(xué)習(xí)和掌握不同類型病害的發(fā)生特點(diǎn)，學(xué)會(huì)田間病害診斷和鑒定的一般方法，明確望、聞、問、切的意義及各種制片方法要領(lǐng)，并能根據(jù)相應(yīng)的病害結(jié)合所學(xué)知識(shí)提出可能的防治措施。

二、材料和用具

（一）實(shí)驗(yàn)材料

采集的各類植物病害新鮮標(biāo)本。

（二）實(shí)驗(yàn)用具

顯微鏡、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、解剖針、放大鏡、刀片、酒精、鹽酸等。

三、內(nèi)容和方法

在田間采集各類植物病害標(biāo)本，挑取其中一種或幾種植物，以其中某一部位（莖、葉、根等）觀察其病害特征，初步診斷病害類型。 然后，對(duì)存在病原物的病害，根據(jù)下述方法進(jìn)行病原鑒定，進(jìn)一步確診病害類型，要求真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲等病害各鑒定幾種。 本實(shí)驗(yàn)由于受作物品種、地理?xiàng)l件、環(huán)境因素、氣候條件等方面的影響，病害的發(fā)生會(huì)有很大的差異。 故在進(jìn)行病害調(diào)查時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況，選擇3~5種作物，每種作物選擇2~3個(gè)品種，根據(jù)已學(xué)知識(shí)對(duì)每種作物上具有典型癥狀的病害進(jìn)行一般調(diào)查和診斷，并填寫表3-1。同時(shí)，選擇幾種僅通過癥狀觀察難以確定的病害，在實(shí)驗(yàn)室做進(jìn)一步的病原鑒定。

（一）真菌病害的診斷和鑒定

真菌病害的鑒定主要是根據(jù)癥狀特征和病原真菌的形態(tài)特征進(jìn)行。 不同的真菌和其他病原物可引起相似的癥狀，因此應(yīng)以病原真菌的鑒定為依據(jù)。

1.癥狀觀察

觀察癥狀時(shí)，先注意病害對(duì)全株的影響（如萎凋、萎縮、畸形和生長習(xí)性的改變等），然后檢查病部。 觀察斑點(diǎn)病害，要注意斑點(diǎn)的形狀、數(shù)目、大小、色澤、排列和有無輪紋等；觀察腐爛病害，要注意腐爛組織的色、味、結(jié)構(gòu)（如軟腐、干腐）以及有無蟲傷等。 注意有無病征，即真菌產(chǎn)生的孢子和子實(shí)體等，放大鏡和解剖鏡在檢查病征時(shí)很有用。 特別值得提出的是，鑒定時(shí)常常會(huì)遇到許多非侵染性病害，它們的癥狀有的與病毒病、線蟲病或有些真菌病害很相似，甚至在上面還能檢查到真菌，當(dāng)然，這些真菌一般是后來在上面生長的腐生性真菌。 非侵染性病害，一般在田間是普遍發(fā)生的，與地形、土壤、品種和氣候等條件有關(guān)，沒有完整的田間記錄有時(shí)是很難鑒定的，最好是就地觀察、調(diào)查和分析，不能單純依靠室內(nèi)檢查。

2.病原菌鑒定

癥狀對(duì)鑒定不是絕對(duì)可靠的，不同的病原物可能產(chǎn)生相似的癥狀，而一種病害的癥狀可能因寄主和環(huán)境條件而變化。 因此，標(biāo)本的顯微鏡檢查非常重要。 真菌病害標(biāo)本或培養(yǎng)的真菌，應(yīng)因材料的不同而采取不同的方法檢視。

（1）菌絲體和子實(shí)體的挑取檢視

標(biāo)本或培養(yǎng)基上的菌絲體或子實(shí)體，一般可直接用挑針挑取少許，放在加有1滴浮載劑的載玻片上，加蓋玻片在顯微鏡下檢視。

（2）葉面真菌的粘貼檢視

葉面真菌的粘貼檢視可用透明膠、醋酸纖維素、火棉膠或其他粘貼劑等。目的是檢查葉片表面的真菌，如白粉菌和其他霉菌等。

（3）組織整體透明檢視

組織透明后的整體檢查，不但可以看清表面的病菌，還可以觀察組織內(nèi)部的病菌。 使組織透明的方法很多，最常用的是水合氯醛。

水合氯醛透明：為了觀察病葉表面和內(nèi)部的病菌，可將小塊葉片在等量的酒精和冰醋酸的混合液中固定24h，然后浸泡在飽和的水合氯醛溶液中，待組織透明后取出用水洗凈，經(jīng)稀苯胺藍(lán)的水溶液染色，用甘油浮載檢視。

（4）真菌的玻片培養(yǎng)檢視

對(duì)于瓊脂培養(yǎng)基表面的真菌，直接挑取檢視往往會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)，故玻片培養(yǎng)是很好的檢視方法。

（5）瓊脂培養(yǎng)基中真菌的檢視

對(duì)于瓊脂培養(yǎng)基表面下的真菌結(jié)構(gòu)，可以從平板上切取小塊帶菌的瓊脂培養(yǎng)基，放在載玻片上，加蓋玻片擠壓后檢視。

（6）真菌細(xì)胞核和染色體的觀察

真菌細(xì)胞核和染色體的觀察對(duì)了解真菌致病性和變異是非常重要的，有時(shí)需要對(duì)真菌染色體的變化或細(xì)胞核進(jìn)行觀察。 細(xì)胞核染色方法很多，通常使用蘇木精染色或DAPI熒光染料染色。

（7）組織浸離檢視

組織浸離就是將根、莖、樹皮等組織用藥處理，除去中膠層，使細(xì)胞分離，以觀察單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)。

（8）徒手切片檢視

徒手切片在教學(xué)和研究上都很有用，不需要特殊設(shè)備，操作方便，是最常用的真菌檢視方法。

3.病原真菌半永久玻片的制作及顯微成像

（1）半永久玻片的制作方法

①準(zhǔn)備載玻片：挑取干凈的載玻片，并用紗布擦干凈。

②滴浮載劑：用滴管滴半滴乳酚油于載玻片上。

③挑取病原物：挑取病原物置于浮載劑中。

④蓋片、封固：輕輕蓋上蓋玻片，將蓋玻片周圍用指甲油封住。

⑤貼標(biāo)簽：貼標(biāo)簽并寫上病原物名稱、寄主植物、制作時(shí)間、制作人等。

（2）顯微成像技術(shù)

①玻片制作：把將要顯微照相的病原物制成臨時(shí)玻片。

②鏡檢：在顯微鏡下觀察，找到需要拍照的結(jié)構(gòu)。

③設(shè)置參數(shù)：打開顯微照相系統(tǒng)，在設(shè)置選項(xiàng)中設(shè)置所需參數(shù)：第一，標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)定設(shè)置倍數(shù)（與當(dāng)前顯微鏡物鏡所使用的倍數(shù)一致）；第二，設(shè)置比例尺，包括比例尺放置的位置、方式（水平或垂直），比例尺的大小、顏色。

④拍照：設(shè)置好參數(shù)后，調(diào)節(jié)顯微鏡的細(xì)調(diào)節(jié)螺旋，使病原物結(jié)構(gòu)在電腦屏幕上盡可能地顯示清晰，點(diǎn)擊拍照按鈕或在屏幕上右鍵單擊拍照，將照片保存在某個(gè)文件夾中即可。

（二）細(xì)菌病害的診斷和鑒定

植物細(xì)菌病害的為害癥狀和發(fā)生發(fā)展規(guī)律并不像病毒病害那樣與真菌有很大的差別，所以鑒定和診斷方法與真菌病害相似，由于細(xì)菌很小，可以作為分類根據(jù)的形態(tài)學(xué)性狀比較少，因此細(xì)菌的鑒定方法與真菌又有所不同。

1.癥狀觀察

植物細(xì)菌病害表現(xiàn)各種類型的癥狀，不同屬的細(xì)菌侵染植物后引起的癥狀有所不同，如棒形桿菌屬細(xì)菌主要引起萎蔫，假單胞菌屬細(xì)菌主要引起葉斑和葉枯（少數(shù)枝枯、萎蔫和軟腐），黃單胞菌屬細(xì)菌主要引起葉斑和葉枯，土壤桿菌屬細(xì)菌主要引起腫瘤，歐文氏菌屬細(xì)菌主要引起軟腐等。 許多細(xì)菌性病害的病斑還帶有水漬狀，有時(shí)可以作為診斷的依據(jù)。 植物病部有時(shí)還有菌膿排出，也可以作為植物細(xì)菌病害的診斷依據(jù)。

2.病原菌鑒定

（1）顯微鏡觀察

顯微鏡觀察對(duì)診斷是非常重要的，細(xì)菌侵染引起的病害，受害部位的維管束或薄壁細(xì)胞組織中一般都有大量的細(xì)菌，用顯微鏡觀察組織有無細(xì)菌流出（噴菌現(xiàn)象）。

（2）病原細(xì)菌分離鑒定

植物病原細(xì)菌一般都用稀釋分離法。 病原細(xì)菌在組織中的數(shù)量很大，稀釋培養(yǎng)可以使病原細(xì)菌與雜菌分開，形成分散菌落，容易分離得到純培養(yǎng)，對(duì)病原細(xì)菌的識(shí)別和鑒定有很大幫助。 病原細(xì)菌的鑒定通常需要進(jìn)行生理生化測(cè)定和致病性測(cè)定。

（三）病毒病害的診斷和鑒定

病毒病害是作物的重要病害，幾乎每種作物都發(fā)現(xiàn)有一種或幾種甚至十幾種病毒病害。 對(duì)于病毒病害，首先要注意它的病理現(xiàn)象，有助于病毒病害的鑒別。

1.癥狀觀察

植物病毒必須經(jīng)過一定的傷口才能侵入寄主植物的細(xì)胞。 例如，葉片經(jīng)摩擦接種病毒后，在接種點(diǎn)可形成局部斑點(diǎn)，有壞死褪綠、黃化等不同顏色，大小也可以不同。 植物病毒從侵入點(diǎn)擴(kuò)散，一般可以擴(kuò)散到全株，表現(xiàn)各種外部癥狀。 植物病毒病的外部癥狀一般可以歸為七種類型：花葉、變色、環(huán)斑（環(huán)紋）、壞死、矮縮、矮化和畸形。 植物病毒病的內(nèi)部癥狀包括組織與細(xì)胞的變化和內(nèi)含體的變化兩個(gè)方面。

2.病毒形態(tài)觀察

不作要求。

（四）線蟲病害的診斷和鑒定

1.癥狀觀察

植物受到線蟲為害后，可以表現(xiàn)各種癥狀，如癭瘤、葉斑、壞死或整株枯死等，通?？梢栽诓∽儾课徽业讲≡€蟲，但是多數(shù)線蟲病表現(xiàn)為變色、褪綠、黃化、矮縮和萎蔫等癥狀，這多半是為害根部造成的。 各屬線蟲為害不同，莖線蟲主要為害植物地下莖，胞囊線蟲多寄生在植物根部支根或須根側(cè)面，根結(jié)線蟲在新生的支根或側(cè)根上寄生后引起根結(jié)，粒線蟲和滑刃線蟲主要為害植物的地上部分，可以傳染植物病毒的長針線蟲、劍線蟲和毛刺線蟲等，在根外寄生。

2.病原鑒定

直接觀察分離胞囊線蟲、根結(jié)線蟲等根部寄生的線蟲，可在解剖鏡下用挑針直接挑取蟲體觀察，對(duì)于一些蟲體較大的線蟲，如莖線蟲和粒線蟲等，可在解剖鏡下用尖細(xì)的竹針或毛針將線蟲從病組織中挑出，放在凹穴玻片上的水滴中，做進(jìn)一步的觀察和處理。

四、實(shí)習(xí)時(shí)間

3天。

五、作業(yè)與思考題

1.填寫病害調(diào)查表。

表3-1 田間一般病害的診斷和鑒定

2.鑒別真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲病害10~20種，交由老師檢查，作為平時(shí)成績。

3.病毒病害分布廣泛，其癥狀也與某些非侵染性病害相似，思考有何簡易方法能有效區(qū)別病毒病害和非侵染性病害。