一、目的要求

學(xué)習(xí)和掌握植物病原菌的一般接種方法及接種體的制備，在溫室人工接種條件下觀測(cè)病原菌的侵染過程，包括孢子萌發(fā)、附著胞的形成等病菌擴(kuò)展過程，直至病害癥狀顯現(xiàn)，并明確病原菌與寄主植物寄生關(guān)系的定義以及病害侵染與病害循環(huán)的關(guān)系。

二、材料和用具

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種材料

（1）玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）

（2）瓜類綿腐病菌（Pythium a phanidermatum）

（3）甘薯黑斑病菌（Ceratocystis fimbriata）

（4）馬鈴薯環(huán)腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicum）

（5）棉花炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）

（6）甘藍(lán)黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris）

2.寄主材料

玉米苗、紅薯塊、棉籽、絲瓜種子或絲瓜幼苗、馬鈴薯塊、甘藍(lán)葉片。

（二）實(shí)驗(yàn)用具

小剪刀、顯微鏡、酒精燈、解剖針、噴槍（噴霧瓶）、小盆缽等。

三、內(nèi)容和方法

（一）實(shí)驗(yàn)原理

從病株上分離得到的真菌、細(xì)菌是否是致病菌，要通過對(duì)寄主植株接種該病菌，看是否能誘發(fā)該植物產(chǎn)生與原來病株相同的癥狀才能確定。 植物病理的接種技術(shù)是病理學(xué)最常用的基本技術(shù)之一，它可以用來鑒定病原物的致病性，選育抗病品種，研究病害發(fā)生過程等。

接種方法一般采用與自然條件下發(fā)病相似的辦法，因此接種類型比較多。在進(jìn)行病原物接種時(shí)，無論采用什么方法，都必須考慮：（1）寄主植物的感病性——供試植物應(yīng)是感病品種，在易感病的發(fā)育階段接種；（2）病原物的致病性——菌種應(yīng)具有較強(qiáng)的致病力，生活力強(qiáng)，有一定的接種量；（3）要?jiǎng)?chuàng)造適宜的發(fā)病條件，主要是溫度和濕度，以利于病菌的萌發(fā)和侵入。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.噴霧接種法

噴霧接種是將病菌的懸浮液，噴灑在寄主植物表面。 經(jīng)氣流和雨水傳播的病害都可以用此種方法接種。 病菌到達(dá)寄主植物表面，經(jīng)氣孔、傷口侵入或經(jīng)表皮直接侵入。 本實(shí)驗(yàn)以玉米小斑病為例，主要步驟如下。

（1）配制孢子懸浮液：在玉米小斑病菌斜面試管內(nèi)加5m L滅菌水，用移植針輕輕在斜面上撥動(dòng)，洗下孢子，用2層紗布過濾，制成孢子懸浮液，顯微鏡下鏡檢，并計(jì)算孢子濃度。

（2）將配制好的孢子懸浮液裝入噴霧瓶中備用。

（3）取健康玉米植株，用棉花輕輕抹掉葉片上的葉面蠟質(zhì)，將孢子液噴于葉片上，主要噴葉背面。

（4）接種后，保濕24~36h，放在室溫下，誘發(fā)癥狀，要求保持土壤濕潤(rùn)，溫度在20℃左右，即可觀察發(fā)病情況。

提示:在配制孢子液時(shí)可滴加少許2%的吐溫-20,以利于孢子黏附在葉片上。

2.針刺接種法

由傷口侵入的病害，可以采用傷口接種。 一般是用滅菌的針刺傷寄主植物組織，然后將病菌接種在傷口內(nèi)，可用此方法接種甘薯黑斑病菌和馬鈴薯環(huán)腐病菌。

（1）將塊根、塊莖切成片或直接在塊根、塊莖上刺出傷口。

（2）用接種針挑取病菌涂抹在傷口上，或者用消毒脫脂棉蘸取病菌孢子懸浮液、細(xì)菌液涂抹傷口。

（3）接種完后保濕，在25℃條件下培養(yǎng)，3~7d后觀察發(fā)病情況。

3.剪葉接種法

此方法適宜經(jīng)水孔、傷口侵入病害的接種，用此方法接種甘藍(lán)黑腐病菌，操作步驟如下。

（1）配制細(xì)菌懸浮液：在甘藍(lán)黑腐病菌斜面試管中加5m L滅菌水，振動(dòng)試管，使細(xì)菌分散在水中形成懸浮液，懸浮液中細(xì)菌濃度為1×107個(gè)/m L左右，將懸浮液倒入小燒杯中。

（2）用在火焰上滅菌的小剪刀在燒杯中蘸取細(xì)菌懸浮液，然后用剪刀剪甘藍(lán)葉片。

（3）接種完后保濕，在25℃條件下誘發(fā)癥狀，5~7d后觀察癥狀。

4.土壤接種法

有些病菌是在土壤中越冬越夏，當(dāng)播種寄主后，病菌隨著寄主的萌發(fā)生長(zhǎng)從根部或地下莖侵入寄主。 用此方法接種瓜類綿腐病菌，操作步驟如下。

（1）把培養(yǎng)的瓜類綿腐病菌，連同少量培養(yǎng)基，拌在土壤中。

（2）把已發(fā)芽的絲瓜種子播在該土壤中或者將絲瓜苗移栽于該土壤中。

（3）在25℃室溫下培養(yǎng)，保持土壤濕潤(rùn)，10~15d后觀察癥狀。

5.浸種接種法

（1）將已脫絨的棉花種子在56℃的恒溫水中浸泡30min，取出稍晾干。

（2）在棉花炭疽病菌斜面試管內(nèi)加入5m L滅菌水，制成孢子懸浮液。

（3）把用溫水浸泡后的棉花種子浸泡在孢子懸浮液中10min，然后將種子播種于無菌土壤中，每缽10粒種子。

（4）接種完后，在20℃條件下培養(yǎng)，注意土壤保持濕潤(rùn)，10~15d后觀察癥狀。

（三）注意事項(xiàng)

1.噴霧時(shí)，以細(xì)霧滴但不形成水膜為最佳。

2.每種接種方法都應(yīng)設(shè)置對(duì)照。

四、實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)

6學(xué)時(shí)。

五、作業(yè)與思考題

1.每人交發(fā)病植株1~2棵（葉片2~3片），并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告1份。

2.針對(duì)不同的病原物應(yīng)如何選擇接種方法？

3.噴霧接種時(shí)加吐溫-20的作用是什么？

4.依據(jù)實(shí)驗(yàn)分析討論病害發(fā)生及流行的三要素。

5.設(shè)想讓玉米小斑病在溫室中繼續(xù)發(fā)展下去，能否觀察到病原菌的第二、三代孢子？