實(shí)驗(yàn)二　血細(xì)胞凝集試驗(yàn)測(cè)定流感病毒效價(jià)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握血凝實(shí)驗(yàn)的方法和原理，了解流感病毒具有凝集雞紅細(xì)胞的能力，掌握一種病毒類(lèi)型測(cè)定的方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

流感病毒表面具有血凝素抗原，具有凝集雞紅血球的能力。當(dāng)病毒血凝素抗原與紅細(xì)胞表面相應(yīng)受體作用后，可導(dǎo)致大量紅細(xì)胞連接在一起，發(fā)生肉眼可見(jiàn)的血球凝集現(xiàn)象。

當(dāng)病毒血凝素抗原與其特異性抗體發(fā)生作用后，血凝素即不再與紅細(xì)胞結(jié)合，血球凝集現(xiàn)象也不會(huì)發(fā)生?？乖贵w的結(jié)合是特異的，因此，由抗體的類(lèi)型可以推測(cè)出病毒的類(lèi)型。

三、實(shí)驗(yàn)材料及器械

(1)收獲的尿囊液(即流感病毒)。

(2)1%雞紅血球、0.85%生理鹽水。

(3)血凝板、吸管、三角瓶。

四、實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.吸取0.9ml生理鹽水于血凝板第2孔，從第3孔至第10孔每孔各加生理鹽水0.4ml。

2.第1孔加入0.4ml尿囊液，第2孔加0.1ml尿囊液，反復(fù)吹打3～4次混勻。

3.從混勻的第2孔中吸取0.4ml至第3孔混勻，再吸0.4ml至第4孔混勻，直到稀釋至第9孔;第9孔經(jīng)稀釋吹打后吸出0.4ml，棄去;第10孔為血球?qū)φ?，即不加尿囊液。以上各?從第1孔到第10孔)的病毒的稀釋度分別為:原液，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1280，空白對(duì)照。

注意事項(xiàng):

各孔內(nèi)液體量應(yīng)均為0.4ml。

4.從第10孔開(kāi)始，按10→1的方向，向每孔加0.4ml 1%雞紅血球，輕輕振蕩均勻，置室溫45min后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄。各孔的總體積應(yīng)為0.8ml。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷

血凝結(jié)果以+ + + + 、 + + + 、 + + 、 + 、 －表示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷(圖2-1):

圖2-1　血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷

紅細(xì)胞均勻分布于孔底者為+ + + + ;

紅細(xì)胞均分布于孔底，但有卷邊現(xiàn)象為+ + + ，即不完全凝集;

紅細(xì)胞在孔底形成一個(gè)小團(tuán)，邊緣光滑圓潤(rùn)者為－ ，紅細(xì)胞完全未被凝集;

紅細(xì)胞在孔底形成一個(gè)環(huán)狀，四周有小凝集塊者以兩個(gè)加號(hào)++表示。

六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄

血凝試驗(yàn)結(jié)果

附:血凝效價(jià)計(jì)算舉例

血凝效價(jià)計(jì)算表

續(xù)表

續(xù)表

*　4為+ + + + ，3為+ + + ，2為+ + ，1為+ 。

注意事項(xiàng):

血球凝集試驗(yàn)的血凝滴度是以出現(xiàn)+ +凝集的病毒稀釋度表示，這一稀釋度病毒液的效價(jià)就是一個(gè)血凝單位。

七、方法評(píng)注

1.背景材料

病毒的毒力指病毒的感染力，即活病毒數(shù)，而不包括缺陷病毒顆?；蛘咭褱缁畹牟《緮?shù)量。測(cè)定病毒的毒力又稱為病毒滴度測(cè)定，主要方法有空斑形成單位、TCID50 (半數(shù)組織培養(yǎng)物感染劑量)等，具體采用哪種方法要看病毒種類(lèi)以及敏感細(xì)胞。目前測(cè)定病毒感染力的常用指標(biāo)有如下幾種:

(1)空斑形成單位:是一種測(cè)定病毒感染性比較準(zhǔn)確的方法。將適當(dāng)濃度的病毒懸液接種到生長(zhǎng)單層細(xì)胞的玻璃平皿或細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，當(dāng)病毒吸附于細(xì)胞上后，再在其上覆蓋一層溶化的半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。當(dāng)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖后，每一個(gè)感染性病毒顆粒在單層細(xì)胞中產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染細(xì)胞病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，若用中性紅等活性染料染色，在紅色的背景中顯出沒(méi)有著色的“空斑” ，清楚可見(jiàn)。由于每個(gè)空斑可以認(rèn)為是由單個(gè)病毒顆粒復(fù)制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位(PFU)來(lái)表示。

(2 )50%致死量(LD50 )或50%組織細(xì)胞病變量(TCID50):該測(cè)定法可用來(lái)估計(jì)所含病毒的感染量。方法是測(cè)定病毒感染雞胚、易感動(dòng)物或組織細(xì)胞培養(yǎng)物，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量。具體操作是將病毒懸液作連續(xù)10倍稀釋?zhuān)臃N于雞胚、易感動(dòng)物或組織細(xì)胞培養(yǎng)物中，經(jīng)一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞或雞胚發(fā)生病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動(dòng)物發(fā)病死亡等，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算50%致死量或50%組織細(xì)胞病變量，即可認(rèn)為是病毒感染性滴度。該方法應(yīng)用方便，可操作性及重復(fù)性強(qiáng)。

TCID50與PFU的換算關(guān)系可用下面公式估計(jì):

PFU =0.7×TICD50 (注:該公式僅作為病毒感染力指標(biāo)的估算公式，不能用于正式文章中)

(3)MOI:病毒感染復(fù)數(shù)，MOI為multiplicity of infection的縮寫(xiě)，中文譯為感染復(fù)數(shù)。MOI源于噬菌體感染細(xì)菌的研究，其含義是感染時(shí)噬菌體與細(xì)菌的數(shù)量比值，即平均每個(gè)細(xì)菌感染噬菌體的數(shù)量。一般認(rèn)為MOI是一個(gè)比值，沒(méi)有單位。由于噬菌體的數(shù)量單位為pfu，因此可認(rèn)為其隱含的單位是pfu number/cell。后來(lái)MOI被普遍用于病毒感染細(xì)胞的研究中，含義是感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，即感染病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，沒(méi)有單位。

(4)其他方法:如血凝實(shí)驗(yàn)等。血凝實(shí)驗(yàn)是測(cè)定流感病毒效價(jià)的最常用的方法之一。

病毒的血凝現(xiàn)象大致可以分為3種類(lèi)型。

(1)可逆型:血凝素與病毒顆粒結(jié)合松，易分開(kāi)，經(jīng)超速離心后，病毒顆粒沉淀于管底，血凝素則游離于上清液內(nèi)。這種血凝素凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象是可逆的，即被凝集的紅細(xì)胞釋放了吸附于表面的血凝素后，可再與該血凝素發(fā)生凝集，如天花、鼠疫等病毒。

(2)不可逆型:血凝素與病毒顆粒結(jié)合得比較緊密，如不經(jīng)過(guò)特殊處理，血凝素與病毒顆粒不能分開(kāi)，這種病毒引起的紅細(xì)胞凝集，往往是不可逆轉(zhuǎn)的，即當(dāng)病毒顆粒從紅細(xì)胞表面游離出來(lái)后，紅細(xì)胞已經(jīng)不能再與病毒結(jié)合，其受體已被破壞。這是由于在一定的溫度(37℃)下，病毒釋放出一種能破壞紅細(xì)胞表面受體糖苷鍵的N-乙酰神經(jīng)氨酸酶，這樣導(dǎo)致當(dāng)病毒顆粒從紅細(xì)胞表面游離出來(lái)后紅細(xì)胞表面受體已被破壞而失去了再凝集病毒的能力，如流感病毒、雞新城疫病毒等。

(3)凝集條件嚴(yán)格型:某些病毒或其血凝素凝集紅細(xì)胞的條件十分嚴(yán)格，有些甚至不僅對(duì)不同種動(dòng)物的紅細(xì)胞有嚴(yán)格的選擇，即使對(duì)同種動(dòng)物，由于性別和年齡的不同，對(duì)紅細(xì)胞的凝集性能亦有差異。如流行性乙型腦炎，其對(duì)公鵝的紅細(xì)胞凝集能力比對(duì)經(jīng)產(chǎn)老齡母鵝的紅細(xì)胞凝集能力要強(qiáng);除此之外，病毒顆粒或其血凝素凝血時(shí)對(duì)緩沖液的pH值、溫度及鹽濃度等的要求也很?chē)?yán)格。

2.影響因素

紅細(xì)胞濃度、稀釋液種類(lèi)和pH值等因素均會(huì)對(duì)血凝實(shí)驗(yàn)造成影響。影響血凝和血凝抑制試驗(yàn)的主要因素有:

(1)酸、堿和沉著的紅細(xì)胞均會(huì)影響血凝實(shí)驗(yàn)。因此實(shí)驗(yàn)室使用的玻璃器材及血凝板均要潔凈。

(2)紅細(xì)胞有動(dòng)物的種類(lèi)及個(gè)體差異性，因此同批實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用同批紅細(xì)胞。滴定雙份血清、抗原分析或比較動(dòng)物群體抗體水平時(shí)應(yīng)安排在同一次試驗(yàn)進(jìn)行，以免材料的不同而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，更為重要的是，假如出現(xiàn)紅細(xì)胞變色和污染就不能使用。

(3)病毒或者血凝素反復(fù)多次凍融也會(huì)導(dǎo)致血凝效價(jià)的降低。

(4)血清中非特異性抑制因素會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故試驗(yàn)前一定要用白陶土或冷丙酮處理。血清在加溫或保存過(guò)程中一旦出現(xiàn)沉淀也容易引起非特異性凝集，這可通過(guò)離心來(lái)除去。

(5)判定結(jié)果一定要在規(guī)定的時(shí)間觀察，每次試驗(yàn)應(yīng)在一定的溫度下進(jìn)行，如流感病毒在37℃時(shí)會(huì)從紅細(xì)胞表面釋放出來(lái)，因此，炎熱的夏天最好在4℃下觀察結(jié)果。