實(shí)驗(yàn)十二　DEAE纖維素柱層析純化酶蛋白

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1．離子交換柱層析進(jìn)一步純化蔗糖酶蛋白。

2．掌握離子交換層析的原理和注意事項(xiàng)。

【實(shí)驗(yàn)原理】

離子交換層析的原理是帶電的生物大分子和離子交換柱填料上的離子基團(tuán)進(jìn)行交換而被分離純化。以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離。能夠分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等。選擇離子交換劑(陰離子或陽(yáng)離子交換劑)，決定于被分離物質(zhì)在所用緩沖液pH值下所帶的電荷性質(zhì)。如pH值高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，應(yīng)選陰離子交換劑，反之應(yīng)選陽(yáng)離子交換劑。交換劑的基質(zhì)是疏水性還是親水性，對(duì)被分離物質(zhì)有不同的作用，因此對(duì)被分離物質(zhì)的穩(wěn)定性和分離效果均有影響。在分離生命大分子物質(zhì)時(shí)，選用親水性基質(zhì)的交換劑較為合適，它們對(duì)被分離物質(zhì)的吸附和洗脫都比較溫和，活性不易破壞。

離子交換劑的種類很多，最常用的是DEAE-纖維素、CM纖維素和離子交換交聯(lián)葡聚糖。一般情況下，DEAE-纖維素用于分離酸性蛋白質(zhì)，而CM纖維素用于分離堿性蛋白質(zhì)。

在離子交換層析前要注意使離子交換劑帶上合適的平衡離子，使平衡離子能與樣品中的組分離子進(jìn)行有效的交換。如果平衡離子與離子交換劑結(jié)合力過強(qiáng)，會(huì)造成組分離子難以與交換劑結(jié)合而使交換容量降低。另外還要保證平衡離子不對(duì)樣品組分有明顯影響。在分離過程中，平衡離子被置換到流動(dòng)相中，它不能對(duì)樣品組分有污染或破壞。如在純水制備過程中用到的離子交換劑的平衡離子是H或OH離子，因?yàn)槠渌x子都會(huì)對(duì)純水有污染。但是在分離蛋白質(zhì)時(shí)，一般不能使用H或OH型離子交換劑，因?yàn)榉蛛x過程中H或OH離子被置換出來都會(huì)改變層析柱內(nèi)pH值，影響分離效果，甚至引起蛋白質(zhì)的變性。

【實(shí)驗(yàn)器材】

層析柱、部分收集器、磁力攪拌器及攪拌子、50 ml小燒杯2個(gè)、玻璃砂漏斗、水泵與抽濾瓶、精密pH試紙或pH計(jì)、三通管、止水夾、吸耳球、石英紫外比色杯、尿糖試紙、點(diǎn)滴板、導(dǎo)率儀。

【藥品試劑】

1．DEAE纖維素:DE-23 1．5 g。

2．0．5 mol/L NaOH100 ml。

3．0．5 mol/L HCl 50 ml。

4．0．02 mol/L pH7．3 Tris-HCl緩沖液250 ml。

5．0．02 mol/L pH7．3(含0．2 mol/L NaCl)的Tris-HCI緩沖液50 ml。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1．離子交換劑的處理:稱取1．5 g DFAE纖維素(DE-23)干粉，加入0．5 mol/L NaOH溶液(約50 ml)，輕輕攪拌，浸泡至少0．5小時(shí)(不超過1小時(shí))，用玻璃砂漏斗過濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加50 ml的0．5 mol/L HCl，攪勻，浸泡0．5小時(shí)，用去離子水洗至近中性，再用0．5 mol/L NaOH重復(fù)處理一次，用去離子水洗至近中性后，抽干備用(因DEAE纖維素昂貴，用后務(wù)必回收)。實(shí)際操作時(shí)，通常纖維素是已浸泡過并回收的，按“堿-酸”的順序洗即可，因?yàn)樗嵯春筝^容易用水洗至中性。堿洗時(shí)因過濾困難，可以先浮選除去細(xì)顆粒，抽干后用0．5 mol/L NaOH-0．5mol/L NaCl溶液處理，然后水洗至中性。

2．裝柱與平衡:先將層析柱垂直裝好，在燒杯內(nèi)用0．02 mol/L pH7．3 Tris-HCl緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然后用此緩沖液洗柱至流出液的電導(dǎo)率與緩沖液相同或接近時(shí)即可上樣。

3．上樣與洗脫:上樣前先準(zhǔn)備好梯度洗脫液。本實(shí)驗(yàn)采用20 ml的0．02 mol/L pH7．3的Tris-HCl緩沖液和20 ml含0．2 mol/L濃度NaCl的0．02 mol/L pH7．3的Tris-HCl緩沖液，進(jìn)行線性梯度洗脫。取兩個(gè)相同直徑的50 ml燒杯，一個(gè)裝20 ml含NaCl的高離子強(qiáng)度溶液，另一個(gè)裝入20 ml低離子強(qiáng)度溶液，放在磁力攪拌器上，在低離子強(qiáng)度溶液的燒杯內(nèi)放入一個(gè)小攪拌子(在細(xì)塑料管內(nèi)放入一小段鐵絲，兩端用酒精燈加熱封口)，將此燒杯置于攪拌器旋轉(zhuǎn)磁鐵的上方。將玻璃三通插入兩個(gè)燒杯中，上端接一段乳膠管，夾上止水夾，用吸耳球小心地將溶液吸入三通(輕輕松一下止水夾)，立即夾緊乳膠管，使兩燒杯溶液形成連通，注意兩個(gè)燒杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。

樣品小心地加到層析柱上，不要擾動(dòng)柱床，注意要從上樣開始時(shí)使用部分收集器收集，控制流速每10分鐘2．5～3 ml。上樣后用緩沖液洗兩次，然后再用約20 ml緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質(zhì)，至A₂₈₀降到0．1以下，夾住層析柱出口，將恒流泵入口的細(xì)塑料導(dǎo)管放入不含NaCl的低離子強(qiáng)度溶液的小燒杯中，用膠布固定塑料管，接好層析柱，打開磁力攪拌器，放開層析柱出口，開始梯度洗脫，連續(xù)收集洗脫液，兩個(gè)小燒杯中的洗脫液用盡后，為洗脫充分，也可將所配制的剩余30 ml高離子強(qiáng)度洗脫液倒入小燒杯繼續(xù)洗脫，控制流速每10分鐘2．5～3 ml。測(cè)定每管洗脫液的A₂₈₀光吸收值。

【注意事項(xiàng)】

1．離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長(zhǎng)。直徑和柱長(zhǎng)比一般為1∶10到1∶50之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時(shí)要均勻平整，不能有氣泡。

2．平衡緩沖液中離子強(qiáng)度和pH值的選擇首先要保證各個(gè)待分離物質(zhì)的穩(wěn)定。其次是要使各個(gè)待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。一般是使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合。注意平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會(huì)大大降低交換容量，影響分離效果。選擇合適的平衡緩沖液，可以直接去除大量的雜質(zhì)，并使得后面的洗脫有很好的效果。

3．上樣時(shí)應(yīng)注意樣品液的離子強(qiáng)度和pH值，上樣量也不宜過大，一般為柱床體積的1%～5%為宜，以使樣品能吸附在層析柱的上層，得到較好的分離效果。

4．在離子交換層析中一般常用梯度洗脫，通常有改變離子強(qiáng)度和改變pH值兩種方式。改變離子強(qiáng)度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強(qiáng)度，從而使與離子交換劑結(jié)合的各個(gè)組分被洗脫下來;而改變pH值的洗脫，對(duì)于陽(yáng)離子交換劑一般是pH值從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH值從高到低。由于pH值可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。

5．洗脫液的選擇首先也是要保證在整個(gè)洗脫液梯度范圍內(nèi)，所有待分離組分都是穩(wěn)定的。其次是要使結(jié)合在離子交換劑上的所有待分離組分在洗脫液梯度范圍內(nèi)都能夠被洗脫下來。另外可以使梯度范圍盡量小一些，以提高分辨率。

6．洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會(huì)造成分離時(shí)間長(zhǎng)、樣品擴(kuò)散、譜峰變寬、分辨率降低，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對(duì)集中于某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率;如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。

【思考題】

1．簡(jiǎn)述離子交換層析的原理和用途。

2．試分析影響離子交換層析分離效果的因素有哪些。