實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目十四　DEAE－纖維素離子交換層析法分離血清蛋白質(zhì)

學(xué)習(xí)目標(biāo)

【知識(shí)目標(biāo)】

（1）能用自己的語(yǔ)言描述離子交換層析法的原理。

（2）能夠迅速而準(zhǔn)確地陳述離子交換層析法的實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)。

（3）能夠準(zhǔn)確鑒別離子交換層析法的結(jié)果，并能說(shuō)明其意義。

【能力目標(biāo)】

（1）能夠正確完成離子交換層析法的各項(xiàng)操作內(nèi)容，做到步驟正確、動(dòng)作連貫協(xié)調(diào)、內(nèi)容全面無(wú)遺漏。

（2）能夠正確操作離子交換層析，并清楚有哪些注意事項(xiàng)。

（3）能夠正確分析離子交換層析的結(jié)果。

案例引導(dǎo)

糖化血紅蛋白（HbA1c）是血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物，能夠反映一段時(shí)間內(nèi)受試者的血糖控制情況，因此它可以作為糖尿病檢測(cè)診斷中的一個(gè)指標(biāo)。我國(guó)的糖化血紅蛋白控制標(biāo)準(zhǔn)為6.5%以下，如果糖尿病患者的糖化血紅蛋白控制標(biāo)準(zhǔn)高于6.5%，那么就要加強(qiáng)血糖的控制，調(diào)整治療方案。運(yùn)用所學(xué)知識(shí)，思考如何從血液中分離檢測(cè)糖化血紅蛋白。

（提示：離子交換層析法）

【實(shí)驗(yàn)原理】

根據(jù)離子交換層析柱上具有可解離的酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)將交換劑分為陽(yáng)離子交換劑（交換基團(tuán)帶負(fù)電荷，能結(jié)合陽(yáng)離子）和陰離子交換劑（交換基團(tuán)帶正電荷，可結(jié)合陰離子）。本實(shí)驗(yàn)采用的是弱堿性陰離子交換劑DEAE－纖維素（二乙基胺乙基纖維素），它的功能基團(tuán)為

DEAE－纖維素一般在pH＜8.6的條件下應(yīng)用，適用于中性蛋白質(zhì)和酸性蛋白質(zhì)的分離，常用來(lái)分離血清蛋白質(zhì)。在本實(shí)驗(yàn)條件下，血清蛋白質(zhì)與DEAE－纖維素的結(jié)合力主要受蛋白質(zhì)分子帶電荷量多少的影響，即帶電荷量越多，與離子交換劑結(jié)合力越強(qiáng)。在pH＞7時(shí)，血清中各種蛋白質(zhì)所帶電荷量由多至少依次為清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白。當(dāng)降低緩沖洗脫液pH值并增加離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫時(shí)，待分離的血清蛋白質(zhì)逐步被洗脫下來(lái)。其次序?yàn)棣茫虻鞍?、β－球蛋白、α－球蛋白、清蛋白?/p>

【實(shí)驗(yàn)器材】

核酸蛋白檢測(cè)儀，記錄儀，20cm×1cm層析柱，部分收集器，梯度混合器。

【藥品及試劑】

DEAE－纖維素，0.5mol/L HCl，0.5mol/L NaOH，0.01mol/L Na₂HPO₄，0.5 mol/L NaH₂PO₄。

操作流程

【操作步驟】

1.DEAE－纖維素的處理

稱取DEAE－纖維素約2.5g，輕撒在盛有40mL 0.5mol/L HCl溶液的100mL量筒的液面上，輕輕振搖，使纖維素緩慢下沉，浸泡30min，然后加蒸餾水至100mL，用玻璃棒攪拌。靜置10min，倒去上清液，重復(fù)加水，靜置后再傾去上清液，反復(fù)2～3次，使上清液中不含微細(xì)混懸物，然后倒入有尼龍濾布（必要時(shí)加一層濾紙）的漏斗中，加水充分洗滌，直到流出液的pH值不小于4（用pH試紙檢查）。

將上述處理的纖維素放入250mL的燒杯中，加0.5mol/L NaOH 40mL，浸泡30min，加蒸餾水至100mL，攪拌后倒入含有尼龍細(xì)布的漏斗中，用水充分洗滌，直到流出液的pH值不大于8，然后將用堿處理過(guò)的上述纖維素置于250mL的燒杯中，加100mL 0.01mol/L Na₂HPO₄攪拌，放置5min，倒去上清液，再加0.01mol/L Na₂HPO₄100mL，反復(fù)幾次，直到pH值為8。

2.裝柱

將層析柱垂直固定好，下端的出水管用螺旋夾夾緊，然后將處理好的纖維素混懸液倒入管內(nèi)，再放松螺旋夾使液體流出，直至纖維素全部加入柱中，且注意液面接近柱床時(shí)再將螺旋夾夾緊（注意：裝柱要均勻，每次加的纖維素之間不要分層，中間不要含有氣泡）。最后可在柱床上端放入一個(gè)圓形濾紙片。

3.加樣

用吸量管小心地在層析柱內(nèi)接近纖維素柱床上緩慢加入血清0.5mL，打開螺旋夾使液體緩慢流出（流速為5～10滴/分）。當(dāng)全部血清進(jìn)入柱床，立刻用滴管加入0.5mL 0.01mol/L Na₂HPO₄。液面接近柱床時(shí)，夾緊螺旋夾，將層析柱下面的橡皮管接到核酸蛋白檢測(cè)儀的進(jìn)樣口，核酸蛋白檢測(cè)儀的出樣口接部分收集器，選擇波長(zhǎng)為280nm。

4.洗脫及檢測(cè)

關(guān)閉梯度混合器的混合閥門和輸出閥門，在輸出口的一端杯內(nèi)加入0.01mol/L Na₂HPO₄200mL，在另一端杯內(nèi)加入0.5mol/L NaH₂PO₄200mL。將梯度混合器放置于高出層析柱30～50cm處，連接梯度混合器和層析柱，接通電源，調(diào)節(jié)攪拌混合速度，打開輸出閥門和混合閥門及層析柱下端的螺旋夾，調(diào)節(jié)層析洗脫液的流速（5～7滴/分），收集洗脫液。

【實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析】

通過(guò)核酸蛋白檢測(cè)儀和記錄儀繪出分離曲線峰值，找到對(duì)應(yīng)收集管，即得到分離蛋白質(zhì)溶液。

【注意事項(xiàng)】

（1）在層析過(guò)程中洗脫不宜太快，應(yīng)控制在5～7滴/分。

（2）層析柱柱床上的洗脫液不能堆積。

（3）加樣時(shí)，不要攪起柱床的纖維素。

【實(shí)驗(yàn)意義】

吸附層析法在醫(yī)藥領(lǐng)域有很廣泛的應(yīng)用，特別是在中醫(yī)藥成分的分離分析上，有重要的作用。

能力檢測(cè)

一、單項(xiàng)選擇題

1.在pH＞7時(shí)，血清中各種蛋白質(zhì)所帶電荷量由多至少依次為（　　）。

A.β－球蛋白、γ－球蛋白、α－球蛋白、清蛋白

B.清蛋白、γ－球蛋白、β－球蛋白、α－球蛋白

C.清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白

D.清蛋白、α－球蛋白、γ－球蛋白、β－球蛋白

E.清蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白、α－球蛋白

2.關(guān)于血清蛋白質(zhì)的下列敘述哪項(xiàng)是錯(cuò)誤的？（　?。?/p>

A.血清總蛋白參考范圍為60～80g/L

B.清蛋白參考范圍為35～50g/L

C.腎病綜合征時(shí)清蛋白與球蛋白比值降低

D.肝硬化時(shí)清蛋白與球蛋白比值升高

E.嚴(yán)重脫水時(shí)，清蛋白與球蛋白比值不變

3.下列有關(guān)血液的敘述，錯(cuò)誤的是（　　）。

A.血漿約占血液總量的55%

B.血細(xì)胞包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板

C.血液在體外后可自行凝固

D.造血系統(tǒng)的疾患可通過(guò)血液影響全身

E.血液檢驗(yàn)只用于各種血液系統(tǒng)疾病