第三節(jié)　激光掃描共聚焦顯微鏡的樣品及其制備

共聚焦顯微鏡可測(cè)定樣品的種類很多，其中包括生物材料，組織（切片），細(xì)胞（亞細(xì)胞）等。

一、組織和細(xì)胞樣品中熒光的來源

1.自發(fā)熒光　組織細(xì)胞不經(jīng)任何熒光染色，便能夠在短波長的激發(fā)下發(fā)射出熒光。很多動(dòng)植物細(xì)胞本身就有熒光。近年來使用的綠色熒光蛋白就具有自發(fā)熒光。在熒光測(cè)定中，有很多自發(fā)熒光會(huì)干擾測(cè)定。

2.熒光染色　很多熒光探針（或稱熒光染料）與組織細(xì)胞作用，能夠在光的作用下發(fā)出特征性的熒光，借以觀察組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，化學(xué)組成和功能。特點(diǎn)是靈敏度高，對(duì)細(xì)胞損害小可做活體染色。

3.免疫熒光　熒光抗體法產(chǎn)生熒光。

4.外源性熒光物質(zhì)進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光　某些藥物，如多柔比星（阿霉素）、四環(huán)素蓄積于細(xì)胞內(nèi)，可使之帶有熒光。

5.誘發(fā)熒光　生物胺類物質(zhì)（如兒茶酚胺）能與某些醛類物質(zhì)在一定條件下發(fā)生縮合反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)熒光，稱誘發(fā)熒光。該法特異性高敏感度高。

6.酶致熒光　某些酶的反應(yīng)產(chǎn)物能夠產(chǎn)生熒光，如脫氫酶反應(yīng)中，輔酶Ⅰ轉(zhuǎn)變成還原型輔酶Ⅰ后可發(fā)出紅色熒光。

在熒光分析中，以上6個(gè)方面常常作為使樣品具有某種熒光的手段。這樣通過直接測(cè)定物質(zhì)自身所發(fā)的“內(nèi)源性熒光”或間接測(cè)定經(jīng)熒光探針標(biāo)記的物質(zhì)的外源熒光，可以測(cè)定細(xì)胞地形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)性質(zhì)等的變化。給樣品中待測(cè)樣品賦予某種熒光的操作稱為熒光標(biāo)記。

二、熒光樣品的制備要求

對(duì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記的操作直接決定實(shí)驗(yàn)的成敗，同時(shí)熒光標(biāo)記的效果又與樣品制備的其他環(huán)節(jié)相聯(lián)系，因此考察樣品制備的是否成功要從總體效果來進(jìn)行。成功的熒光標(biāo)記樣品應(yīng)具有以下特征：①熒光標(biāo)記反應(yīng)的特異性強(qiáng)，熒光信號(hào)定位準(zhǔn)確，這一點(diǎn)在標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)分子和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí)尤為重要；②保持樣品應(yīng)有的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性，其中包括不改變生物樣品的反應(yīng)活性，不干擾其正常的狀態(tài)，毒副作用小；③熒光信號(hào)的響應(yīng)準(zhǔn)確、靈敏，具有可重復(fù)性；④熒光強(qiáng)度適宜，如果熒光太弱不易檢出，太強(qiáng)會(huì)超出監(jiān)測(cè)范圍，圖像精細(xì)結(jié)構(gòu)不清晰，還造成光譜交叉、背景過強(qiáng)、定位不清等干擾；⑤熒光穩(wěn)定性好；⑥樣品內(nèi)熒光應(yīng)均勻分布；⑦兩種或兩種以上的熒光信號(hào)之間的熒光光譜交叉可以得到消除；⑧圖像背景干凈，干擾雜質(zhì)少。

三、常用的熒光標(biāo)記方法

（一）免疫熒光標(biāo)記

在目的蛋白定位、定量研究中可以用針對(duì)該蛋白的特異性的抗體來進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)目的蛋白進(jìn)行標(biāo)記的方法通常有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記。直接標(biāo)記是指帶有熒光素的一抗直接與目的蛋白結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記；間接標(biāo)記是指一抗和目的蛋白結(jié)合，然后再用帶有熒光素的抗一抗的二抗與一抗結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記。間接標(biāo)記有信號(hào)放大作用但非特異性熒光也會(huì)較高。

1.免疫熒光單標(biāo)記法　是指標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子。染色方法如下。

（1）所需材料與試劑：培養(yǎng)在蓋玻片上融合到70%～80%的細(xì)胞，一抗、熒光標(biāo)記的二抗、4%多聚甲醛固定液、封閉液、0.01mol/L PBS緩沖液及0.3%Triton X－100－PBS。

（2）染色方法

1）取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片PBS清洗2～3次。

2）加0.3%的Triton X－100，37℃作用30分鐘。

3）加入4%多聚甲醛室溫固定30分鐘。

4）正常羊血清封閉，室溫30分鐘。

5）加一抗孵育，37℃1小時(shí)或4℃過夜。

6）0.3%的Triton X－100洗5分鐘，0.01mol/L PBS洗5分鐘，重復(fù)一次。

7）加入熒光標(biāo)記的二抗37℃作用1小時(shí)。

8）0.3%的Triton X－100洗5分鐘，0.01mol/L PBS洗5分鐘，重復(fù)一次，用濾紙吸干。

9）90%甘油（PBS配置）封片。

2.免疫熒光雙標(biāo)記法　是指同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子。標(biāo)記時(shí)應(yīng)注意兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊且應(yīng)盡量遠(yuǎn)離，通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等組合。染色時(shí)通常兩種一抗可以同時(shí)孵育，然后同時(shí)孵育兩種二抗。但當(dāng)染色結(jié)果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強(qiáng)時(shí)，應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗且延長孵育時(shí)間。其他步驟同免疫熒光單標(biāo)記。此外還有免疫三標(biāo)記法等，見表9－1。

表9－1　免疫熒光標(biāo)記法

（二）熒光蛋白的示蹤

常用的熒光蛋白是GFP，首先從水母中發(fā)現(xiàn)，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光。目前通過對(duì)GFP的改建，已有多種發(fā)射不同顏色熒光的熒光蛋白，如藍(lán)色熒光蛋白（BFP）、黃色熒光蛋白（YFP）及青色熒光蛋白（CFP）等。BFP融合蛋白和GFP融合蛋白，或GFP融合蛋白和RFP融合蛋白可以雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行多色熒光蛋白的定位。

外源基因與GFP DNA相連，GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)外源基因的表達(dá)。熒光蛋白的出現(xiàn)是一項(xiàng)技術(shù)上的革命，它將復(fù)雜的生化過程與活細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)功能連接在一起，可以在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)跟蹤目標(biāo)蛋白的分布。主要應(yīng)用：①對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位和動(dòng)態(tài)觀察；②GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可動(dòng)態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到胞外的過程；③熒光蛋白可用于在FRET測(cè)量中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用；④熒光蛋白作為生物傳感器，可用來描述信號(hào)傳導(dǎo)，如PKC激活后，從胞質(zhì)到核膜的轉(zhuǎn)位；⑤GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染，就能顯示出細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程；⑥可用于雙標(biāo)或三標(biāo)。以上這些熒光蛋白的應(yīng)用全部可以借助激光掃描共聚焦顯微鏡來實(shí)現(xiàn)。

（三）核酸標(biāo)記方法

檢測(cè)核酸的前提是需要將核酸用熒光探針標(biāo)記。熒光探針分子與核酸的結(jié)合主要有3種方式：①嵌入性結(jié)合方式，即熒光探針分子直接嵌入DNA的兩個(gè)堿基之間，每隔幾個(gè)堿基嵌入一個(gè)熒光分子，這種結(jié)合緊密、穩(wěn)定；②結(jié)構(gòu)親和方式，以靜電力結(jié)合，這種結(jié)合極弱，常造成熒光分子的丟失；③以共價(jià)鍵方式結(jié)合，該染色方式費(fèi)時(shí)，細(xì)胞丟失多，熒光分子丟失多。以下為幾種重要的核酸熒光探針。

1.碘化丙啶（PI）　屬嵌入性熒光探針，與核酸反應(yīng)迅速，可以嵌入到雙鏈DNA和RNA堿基對(duì)中與之結(jié)合，無堿基特異性。PI染色可同時(shí)標(biāo)記出雙鏈DNA和RNA的總和，經(jīng)RNA酶處理出去雙鏈RNA的干擾后，可定性和定量觀察DNA。PI因不能進(jìn)入完整細(xì)胞膜，可用來檢測(cè)細(xì)胞的死活。樣品為活細(xì)胞時(shí)，可直接向活細(xì)胞培養(yǎng)液中加入PI，使終濃度為1～15μg/ml，室溫染色5～15分鐘；樣品為固定細(xì)胞時(shí)，用含有1～10μg/ml的PBS染液，染5～15分鐘。

2.Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI　這3種都是DNA特異性熒光探針，主要結(jié)合在DNA的A－T堿基區(qū)。結(jié)合后都是以紫外光激發(fā)，發(fā)射明亮藍(lán)色熒光。當(dāng)DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)熒光強(qiáng)度增加20倍，與單鏈DNA結(jié)合時(shí)，無熒光增強(qiáng)。這3種探針均可用蒸餾水配成1mg/ml的儲(chǔ)存液，使用時(shí)用PBS稀釋成1μg/ml，室溫染色15～30分鐘，洗滌后共聚焦顯微鏡下觀察。

3.吖啶橙（AO）　即可標(biāo)記DNA又可標(biāo)記RNA，用藍(lán)光激發(fā)后能夠發(fā)出綠、紅兩種熒光。AO與核酸的結(jié)合分為強(qiáng)弱兩種方式：①強(qiáng)結(jié)合方式，為AO插入到雙鏈核酸的堿基對(duì)之間，結(jié)合穩(wěn)定，主要是AO分子與DNA的結(jié)合，熒光發(fā)射峰為530nm，呈綠色熒光；②弱結(jié)合方式，AO分子與核酸分子通過靜電吸引結(jié)合，主要是AO與RNA分子的結(jié)合，發(fā)射波長為640nm，呈紅色熒光。染色方法：①新鮮細(xì)胞涂片或其他標(biāo)本迅速放入95%乙醇固定10～15分鐘，干燥后用1%醋酸酸化30秒；②用0.1mg/ml AO溶液［0.1g AO溶于1LPBS（pH值為4.8）］染色5～10分鐘，PBS洗滌1分鐘；③用0.1mol/L的氯化鈣分化30分鐘，水洗，隨時(shí)在熒光顯微鏡下觀察，直到DNA和RNA顯色清晰為止；④再用上述PBS沖洗3次，細(xì)胞核的DNA呈現(xiàn)亮綠色或黃綠色熒光，胞質(zhì)和核仁的RNA呈現(xiàn)橘紅色熒光。

（四）細(xì)胞內(nèi)離子標(biāo)記方法

在實(shí)驗(yàn)中有時(shí)需要測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)離子的動(dòng)態(tài)變化，如K＋、Na^＋、Ca^2＋、Mg^2＋、H＋的濃度變化和胞內(nèi)分布等情況。激光共聚焦顯微鏡除了能給出被標(biāo)記物濃度與時(shí)間的曲線外，還能準(zhǔn)確實(shí)時(shí)的采集該標(biāo)記物的分布和強(qiáng)度的二維圖像，從而給出被標(biāo)記物在某特定因素影響下其空間分布隨時(shí)間變化的時(shí)空信息。如果共聚焦顯微鏡獲取圖像的速度足夠快，甚至能夠捕捉被標(biāo)記物的瞬間變化情況。

不同的離子需要不同的探針進(jìn)行標(biāo)記才能在共聚焦顯微鏡下觀察。Ca^2＋常用的探針有Fluo－3、Fura Red、Calcium Green－1、Calcium Orange等，這類探針多為Ca^2＋螯合劑，不與Ca^2＋結(jié)合時(shí)不發(fā)光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯（AM）相連方可進(jìn)入細(xì)胞。與AM相連的Ca^2＋探針，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后AM被胞內(nèi)酯酶水解，并與細(xì)胞內(nèi)游離Ca^2＋結(jié)合后發(fā)出熒光。Na^＋常用的探針為Sodium Green，是唯一Ar^2＋激光器可激發(fā)的Na^＋熒光探針，當(dāng)與Na^＋結(jié)合后熒光發(fā)射強(qiáng)度增強(qiáng)。H＋常用的探針為BCECF、SNARF－1、SNAFL、HPTS等。以下以Ca^2＋的Fluo－3探針為例介紹標(biāo)記方法：

1.所需材料和試劑

（1）培養(yǎng)在蓋玻片上融合到70%～80%的細(xì)胞。

（2）Tyrod鹽溶液：5mmol/L HEPES，136mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，1mmol/L MgCl₂，1.9mmol/L CaCl₂，5.6mmol/L葡萄糖，用Tris調(diào)pH值至7.4。

（3）Tyrod－BSA：加0.1%的BSA到Tyrod鹽溶液中。

（4）Hank鹽溶液。

（5）用蔗糖將含BSA和不含BSA的緩沖液的滲透壓調(diào)至310mOsm/L。

（6）將Fluo－3溶于DMSO至1mmol/L，制成儲(chǔ)存液，再溶于Tyrod－BSA或Hank鹽溶液中，終濃度為5～15μmol/L。

2.負(fù)載方法

（1）將培養(yǎng)在載玻片上的細(xì)胞用Tyrod鹽溶液或Hank鹽溶液洗3次。

（2）取60～100μl Fluo－3滴于蓋玻片細(xì)胞表面上，用封口膜將液體展平，室溫孵育40～60分鐘，37℃孵育30分鐘（注意保持細(xì)胞濕潤）。

（3）負(fù)載后，細(xì)胞用Tyrod－BSA液洗2次，再用Tyrod液洗2次；或直接用Hank鹽溶液洗細(xì)胞3次。

（4）將負(fù)載好的細(xì)胞在室溫放置15分鐘，以使酯酶充分水解。

（五）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器標(biāo)記方法

一些熒光探針可以直接用于或細(xì)胞內(nèi)某些細(xì)胞器和膜的定位，如標(biāo)記質(zhì)膜的Di－8－ANEPPS、標(biāo)記線粒體的Mito Tracker Green、標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的DiOC₆（3）、標(biāo)記高爾基體的NB－DC6－ceramide、標(biāo)記細(xì)胞核的Syto stains等。這些探針可用于和其他功能性探針進(jìn)行雙標(biāo)記或三標(biāo)記。例如，DiOC₆（3）標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)方法：

1.所需材料和試劑　培養(yǎng)在蓋玻片上融合到70%～80%的細(xì)胞，DiOC₆（3）儲(chǔ)存液。

2.負(fù)載方法

（1）DiOC₆（3）儲(chǔ)存液的制備：將DiOC₆（3）溶于DMSO中，濃度為1mmol/L。

（2）DiOC₆（3）工作的制備：HEPES－NaCl緩沖液或Hank液稀釋1mmol/L的DiOC₆（3）儲(chǔ)存液，使終濃度為50nmol/L。

（3）用50nmol/L DiOC₆（3）工作液孵育細(xì)胞，室溫3～5分鐘，避光。

（4）負(fù)載后用HEPES－NaCl緩沖液或Hank液洗細(xì)胞3次。

（方寧濤　潘鑾鳳）

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