3．2．1　Cu，Zn－SOD分子的高級結(jié)構(gòu)

3．2．1．1　Cu，Zn－SOD的二級結(jié)構(gòu)

Raman光譜測定牛血Cu，Zn－SOD的二級結(jié)構(gòu)表明：含有3．0%的α螺旋，41．5%的β結(jié)構(gòu)及51．9%的無序結(jié)構(gòu)，與X射線晶體結(jié)構(gòu)分析和傅里葉紅外光譜得出的結(jié)論十分相近。與Cu，Zn－SOD的二級結(jié)構(gòu)相比較，其金屬取代衍生物Cu，Ni－SOD的β結(jié)構(gòu)含量相對減少而無序結(jié)構(gòu)含量增加。用光譜法測定Cu，Ni－SOD活性為Cu，Zn－SOD的40%，這說明SOD的活性隨β結(jié)構(gòu)的減少，無序結(jié)構(gòu)的增加而降低，這是由于在SOD中，其每個亞基的活性中心均是β折疊相互環(huán)繞而形成的一個長而深的活性通道，銅和鋅位于其中，鋅起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，而銅主要起催化作用。β折疊的減少，可能改變了活性中心的結(jié)構(gòu)，尤其是Cu（Ⅱ）周圍固有的配位環(huán)境，因而使酶活性降低。

圖3－6　Cu，Zn－SOD亞基結(jié)構(gòu)示意圖

β折疊片以箭頭表示，Z字型代表二硫鍵，2個長環(huán)由β折疊片伸出形成活性通道的上部與下部，Cu、Zn處于活性中心的底部。從所示方向看Cu離子處于分子的邊緣，Zn離子埋藏于分子內(nèi)部。右下小圖為β桶的希臘環(huán)拓撲圖。

Cu，Zn－SOD酶的相對分子質(zhì)量較大，約為32kD，每個亞基均由8股反平行折疊片組成一個展開的圓桶，其外部有三個長環(huán)，Cu、Zn離子位于距離長通道底部6．3處，居于桶外表面兩個長環(huán)之間。一個二硫鍵起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用。圖3－6為Cu，Zn－SOD亞基結(jié)構(gòu)示意圖。

在Cu，Zn－SOD家族中，以牛紅細胞SOD的研究最為透徹。對植物中SOD的研究較少，現(xiàn)以菠菜葉中的SOD晶體結(jié)構(gòu)為例加以說明。

Cu，Zn－SOD的每個亞基中，除1～2小段螺旋外，其余均為β折疊片和環(huán)狀結(jié)構(gòu)。154個氨基酸殘基形成由8股反平行的β折疊組成的一個展開圓桶和三個外部的環(huán)。圖3－7標示出菠菜葉Cu，Zn－SOD二級序列及主鏈氫鍵圖。

圖3－7　菠菜葉Cu，Zn－SOD二級結(jié)構(gòu)的框架圖及主鏈間氫鍵

在Cu，Zn－SOD的每個亞基結(jié)構(gòu)中，154個氨基酸殘基形成8股反平行的β折疊片，組成的一個展開圓桶和三個外部的環(huán)。主鏈的氫鍵連著β折疊片，穩(wěn)定整個β桶結(jié)構(gòu)。

除去二硫鍵（Cys57－Cys146）與鹽鍵以外，肽鏈像一條連貫的繩索不被間斷，8個反平行的折疊股形成一個希臘鑰匙形（折疊桶與牛血Cu，Zn－SOD具有相同的拓撲結(jié)構(gòu)，從N－端開始順時針前進，三個長環(huán)由它們所連接的一折疊股來命名）。如圖3－7所示，在154個殘基中，有71個殘基是β結(jié)構(gòu)，73個殘基參與環(huán)的組成（36個在環(huán)6，5上；3個在環(huán)4，7上；24個在環(huán)7，8上）。二硫鍵S—S鍵長為2．08，與小分子的二硫鍵S—S鍵長相似。

菠菜葉Cu，Zn－SOD與牛血Cu，Zn－SOD的結(jié)構(gòu)異同點如下。

（1）相似處?、倬哂蓄愃频耐負浣Y(jié)構(gòu)，除配位殘基外，在活性部位周圍的一些功能重要的殘基也被保留在SOD結(jié)構(gòu)中，如Arg143，Thr137，Gly141，Asp124。

②八個上邊緣的殘基與牛Cu，Zn－SOD的結(jié)構(gòu)相同，包括Thr136，Thr137，Gly138，Asn139，Ala140，Gly141，Gly141和Arg143。從SOD保留下來的相同殘基可以看出，不同來源的SOD具有較好的同一性和保守性。

（2）不同處　菠菜葉Cu，Zn－SOD的活性中心Cu^2＋上缺少一個配位的水分子。

3．2．1．2　Cu，Zn－SOD的單體結(jié)構(gòu)

A．pH5．0條件下還原型牛紅細胞Cu，Zn－SOD單體結(jié)構(gòu)

這種來自牛紅細胞的SOD是一個相對分子質(zhì)量為32kD的同型二聚體。每個單體部分都包含一個鋅離子和一個銅離子，但只有銅是催化作用所必需的。

酶在穩(wěn)定狀態(tài)下顏色由綠向藍的轉(zhuǎn)變表明，在該酶催化周期中，銅離子在＋2和＋1兩氧化狀態(tài)之間相互轉(zhuǎn)變。通過X射線衍射方法及化學(xué)、物理方法的研究，對于牛、人類及兩棲動物的紅細胞的氧化型Cu，Zn－SOD的結(jié)構(gòu)特點已有很好的認識，與來自酵母、菠菜和原核生物的Cu，Zn－SOD一樣，具有獨特的三級結(jié)構(gòu)，如圖3－8所示。該三級結(jié)構(gòu)包含8條反平行的β折疊形成的桶及環(huán)（Ⅰ—Ⅶ）?；钚圆课晃挥讦峦巴獗谂c伸展的環(huán)Ⅶ之間，環(huán)Ⅶ在圓錐形狹窄凹槽的底部，其中的凹槽主要是為了容納超氧化物底物。凹槽由帶電的殘基包圍著，這些殘基能夠通過靜電作用與底物連接。凹槽中含一個Cu離子和一個Zn離子，Cu離子與四個His的N原子連接，還與一個H₂O疏松連接。其中的His61在正常情況下架在Cu，Zn之間，Zn與兩個His和一個Asp組成四面體型。

圖3－8　牛紅細胞Cu，Zn－SOD單體結(jié)構(gòu)圖示

（摘自S Mangani，et al．，JBIC，1998）

Cu，Zn－SOD單體的折疊草圖及活性部位凹槽的草圖分別如圖3－8中的（a）和（b）所示。后者顯示了二級結(jié)構(gòu)的排序及相關(guān)的活性部位殘基。

B．Cu，Zn－SOD的四級結(jié)構(gòu)

三維結(jié)構(gòu)的一般概貌如下。

（1）二聚體中的兩個亞基由一近似的二重軸聯(lián)系。

（2）二聚體中的每個亞基為由8條反平行β－片層形成的桶狀結(jié)構(gòu)，如圖3－9所示。

圖3－9　牛紅細胞Cu，Zn－SOD的高級結(jié)構(gòu)

牛紅細胞Cu，Zn－SOD是一個相對分子質(zhì)量為32kD的功能性的同質(zhì)二聚體，每個亞基包含1個Cu原子和1個Zn原子。Cu，Zn－SOD亞基的結(jié)構(gòu)核心是一個由8股反平行的β折疊圍成的圓筒狀結(jié)構(gòu)——β桶（β－barrel），被三個較長的、位于外部的環(huán)狀（p）區(qū)域所連接。

（3）每個亞基中包含一個Cu原子和一個Zn原子，它們之間的距離為6左右，形成酶的雙金屬催化中心。

（4）活性中心距酶表面約10左右。

Cu，Zn－SOD存在三個功能重要的區(qū)域：第一結(jié)構(gòu)域從序列49到84，形成了暴露的長環(huán)，含有和Cu/Zn配位的His和Asp殘基；第二個結(jié)構(gòu)域從序列121到144，組成了第二個活性位點外露環(huán)（active－site lid p），這一區(qū)域含有7個靜電的殘基，Glu132，Glu133，Lys136，Thr137和Arg143位于活性通道的上部邊緣，可識別超氧陰離子底物；第三個結(jié)構(gòu)域是從殘基145到153的羧基末端β鏈（βstrand 8h），它對亞基的連接起著重要的作用。